论文部分内容阅读
金樱子(Rosa laevigata Michx.),属于蔷薇科植物,广泛地分布于中国东部、中部、南部和西南部地区,是一种具有极高食药价值的浆果,富含多糖等功效因子。本文以金樱子果肉为原料,对金樱子果肉多糖(PPRLMF-2)的分离纯化、结构鉴定、生物活性(如抗氧化、巨噬细胞免疫调节、极化调节和抑制其泡沫化等)及其作用机制进行了系统的研究。同时,通过硒化修饰成功制备出硒化金樱子果肉多糖(Se-PPRLMF-2),并对其免疫调节和抗氧化活性及相关机制进行了系统的探究,主要研究结果如下:(1)经水提-除蛋白-脱色-醇沉-冷冻干燥后得到金樱子果肉粗多糖,得率为10.36%。采用离子交换柱层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)分离纯化得到PPRLMF-1和PPRLMF-2两个多糖组分。PPRLMF-2进一步用葡聚糖凝胶层析(Saphadex-G100)纯化后得到纯度为96.8%的PPRLMF-2纯品。(2)通过高效凝胶渗透色谱、单糖组成、甲基化分析、1D和2D核磁共振波谱、红外光谱、刚果红实验和扫描电镜等对PPRLMF-2进行结构表征。PPRLMF-2的平均分子量为137.1 k Da,由鼠李糖(7.6%)、阿拉伯糖(26.5%)、木糖(3.5%)、甘露糖(0.9%)、葡萄糖(5.7%)、半乳糖(31.9%)和半乳糖醛酸(23.9%)组成。PPRLMF-2有16种糖苷键,主要为T-Araf-(1→、T-Rhap-(1→、→5)-Araf-(1→、→4)-Galp-(1→、→4)-Glcp-(1→、→6)-Galp-(1→和→3,6)-Galp-(1→,其中PPRLMF-2的主要糖醛酸的类型为→4)-α-D-Galp A-(1→。PPRLMF-2同时存在α和β两种吡喃糖环构型,表面存在螺旋状的褶皱,具有三螺旋结构。(3)PPRLMF-2具有良好的ABTS·+清除能力、氧自由基吸收能力以及Fe3+还原能力,是良好的电子供体。此外,PPRLMF-2可显著抑制AAPH诱导的红细胞氧化性溶血,减少AAPH导致的红细胞内ROS过表达和脂质过氧化产物MDA的产生,使红细胞内抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)以及GSH含量维持在正常水平,保持红细胞内的生理平衡和稳态。(4)PPRLMF-2具有良好的免疫调节活性,可显著增强RAW264.7细胞的胞饮能力和吞噬能力,通过与RAW264.7细胞膜表面的主要识别受体SR(CD36)、GR、TLR2和TLR4(TLR2为主)相结合,促进MAPKs(包括p38、ERK和JNK)以及NF-κB(p65)信号通路相关因子的磷酸化,激活RAW264.7细胞的免疫应答,促进细胞因子(TNF-α、IL-6和NO)的转录、合成和分泌。(5)PPRLMF-2可适度诱导M0型和M2型巨噬细胞向M1型转化,无法诱导M1型巨噬细胞向M2型转化,但可抑制LPS诱导的炎症反应。PPRLMF-2可抑制泡沫细胞的增殖,并通过与ox LDL发生相互作用、将M0型巨噬细胞转化为M1型或与ox LDL竞争性地结合CD36位点等三种方式中的一种或多种方式协同,抑制巨噬细胞对ox LDL的摄取,阻止其泡沫化,改善由ox LDL导致脂质积累和炎症状态。(6)通过HNO3-Na2SeO3法成功制备硒化金樱子果肉多糖(Se-PPRLMF-2),得率为32.67%。Se-PPRLMF-2形貌变为无规则细丝状,平均分子量减少至82.2 k Da,硒含量为862μg/g。与PPRLMF-2相比,Se-PPRLMF-2红外光谱763.78 cm-1和915.19 cm-1处分别出现Se=O和C-O-Se的特征吸收峰;核磁共振13C谱显示65.7 ppm出现新的吸收峰表明硒化反应在PPRLMF-2的C-6位发生了非选择性的氧硒基取代反应,这些结果均表明多糖被成功硒化。Se-PPRLMF-2可显著提高对自由基的清除能力,有效抑制AAPH诱导的红细胞氧化损伤,减少对高活性抗氧化酶(CAT、GSH-Px和SOD等)以及GSH的需求。Se-PPRLMF-2可显著增强RAW264.7细胞的免疫应答,提高其胞饮和吞噬能力,促进细胞因子(TNF-α、IL-6和NO)的分泌。Se-PPRLMF-2增强抗氧化活性与单纯的硒元素无关,但与有机硒的成键方式导致的多糖构象改变以及提供氢原子和羟基的能力增强密切相关;Se-PPRLMF-2增强巨噬细胞的免疫应答与硒元素有关,但有机硒的作用效果显著强于无机硒,并且显著降低硒的毒性。综上所述,PPRLMF-2是一种新的金樱子果肉多糖,具有良好的抗氧化、巨噬细胞免疫调节、极化调节和抑制其泡沫化等活性,可作为预防免疫低下、动脉粥样硬化以及氧化应激相关疾病的保健药物和功能食品被开发利用。同时,硒化金樱子果肉多糖可作为新型增强免疫和抗氧化的硒源膳食补充剂被推广和使用。