目的:E盒结合锌指蛋白2(E-box binding zinc finger protein 2,ZEB2)是一类具有手指状结构域的转录因子,对基因调控起重要作用。目前,在人类的多种恶性肿瘤中,如膀胱癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌中均有ZEB2表达增高,且其表达量的增加与肿瘤的恶性演进及不良预后密切相关。但对于ZEB2在食管鳞癌中表达及其相关机制研究未见报道,ZEB2抑制E-钙黏附蛋白(E-cadherin)的转录是通过与E-cadherin启动子区的E-box序列相结合,使得E-Cadherin表达降低,最终促使EMT的发生。同时TGF-β1也诱导EMT发生,本研究以食管癌组织及细胞株为研究对象,研究ZEB2在食管鳞癌(esophageal squamous carcinoma,ESCC)组织及人食管癌细胞株kyse140、TE1、Ca ES-17、Eca-109中的表达及意义,通过对ZEB2基因干扰和ZEB2过表达质粒构建,同时给予TGF-β1诱导来探讨ZEB2对上皮间质转化(EMT)和细胞极性(Cell polarity)的影响,进一步明确ZEB2对食管癌侵袭转移的影响。方法:1、采用免疫组织化学SP法检测ZEB2和E-cadherin在218例ESCC患者癌组织(ESCC组)及60例ESCC患者癌旁>5cm的正常食管组织(对照组)中的表达情况,采用Kaplan-Meier进行生存分析,应用Cox回归模型分析影响预后相关因素。分析在食管癌中ZEB2和E-cadherin的表达与临床病理相关参数间的关系,采用RT-PCR法检和Western blot检测食管癌细胞株kyse140、TE1、Ca ES-17、Eca-109中ZEB2 m RNA、CRB3 m RNA和E-cadherin m RNA的表达以及与之对应蛋白的表达。2、筛选ZEB2干扰效率高的si RNA片段,然后将干扰效率高的实验细胞分为4组,即LV-NC-si RNA组、LV-ZEB2-si RNA组、TGF-β1+LV-NC-si RNA组、TGF-β1+LV-ZEB2-si RNA组。分别检测TGF-β1诱导下干扰ZEB2前后的人食管癌Ca ES-17细胞生物学行为的变化,经RT-PCR及Western blot法分别检测ZEB2基因干扰对E-cadherin m RNA、vimentin m RNA、CRB3 m RNA以及与之对应蛋白表达的影响,采用Transwell小室测定细胞的侵袭能力,划痕实验检测细胞的迁移能力。3、构建ZEB2过表达质粒pc DNA3.1(+)/ZEB2,感染kyse140细胞,然后将实验细胞分为4组,分别为pc DNA3.1(+)组、TGF-β1+pc DNA3.1(+)组、pc DNA3.1(+)/ZEB2组、TGF-β1+pc DNA3.1(+)/ZEB2组。分别检测TGF-β1诱导下ZEB2过表达前后的人食管癌kyse140细胞生物学行为的变化,经RT-PCR及Western blot法分别检测ZEB2基因过表达对E-cadherin m RNA、vimentin m RNA、CRB3 m RNA以及对应蛋白表达的影响,分别采用Transwell小室和划痕实验测定细胞的侵袭和迁移能力,在体水平,采用裸鼠转移瘤模型观察ZEB2对肺转移能力的影响。4、根据裸鼠的体重进行随机分组并进行编号,每组6只,分成2组。在小鼠进行环境适应期间,将Kyse140细胞分为2组分别为pc DNA3.1(+)组、pc DNA3.1(+)/ZEB2组细胞的培养在尾静脉注射第12周时小鼠通过引颈法被处死后打开胸腔,摘取出肺组织,观察大体及病理情况。结果:1、ESCC组ZEB2表达率(35.3%)高于对照组(18.3%)(P<0.05),ZEB2的表达与肿瘤浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05),而与患者的性别、年龄和分化程度无关(P>0.05)。采用Kaplan-Meier生存分析结果显示,ZEB2阳性表达组和阴性表达组患者术后中位生存时间分别为17.20个月和37.97个月,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。ESCC组E-cadhedn阳性表达率(45.8%)明显低于癌旁组织(66.7%),两组间差异有统计学意义(P<0.05);其表达与年龄、性别和肿瘤大小、肿瘤分化程度、没润深度和TNM分期无关(P>0.05),而仅与淋巴结转移(P<0.05)密切相关。采用Kaplan-Meier生存分析显示,E-cadherin阳性表达组和阴性表达组患者术后中位生存时间分别为24个月和34个月,但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。ZEB2阳性表达同时E-cadherin阴性表达组中位生存时间为15个月,低于ZEB2阴性表达同时E-cadherin阳性表达组为43.47个月,差异有统计学意义(P=0.002)。2、ESCC组ZEB2与E-cadherin表达呈负相关性(r=-0.469,P<0.01);癌旁组织中ZEB2与E-cadherin表达呈负相关性(r=-0.689,P<0.01);采用Cox比例风险模型分析显示ZEB2阳性表达可作为ESCC预后的独立因素。3、食管癌Ca ES-17细胞中ZEB2 m RNA相对表达量最高,kyse140细胞中ZEB2m NRA相对表达量最低,而食管癌kyse140细胞中Ecadherin m NRA相对表达量最高,Ca ES-17细胞中Ecadherin m RNA相对表达量最低,且在食管鳞癌细胞中ZEB2与E-cadherin表达呈负相关。4、干扰ZEB2后荧光定量PCR检测各组细胞CRB3及E-cadherin表达水平,结果显示LV-ZEB2-si RNA组与LV-NC-si RNA组的细胞相比,ZEB2 m RNA的表达明显减少;而LV-ZEB2-si RNA组的kyse140细胞,TGF-β1(+)和TGF-β1(-)的E-cadherin m RNA和CRB3 m RNA的表达减少均被逆转;但TGF-β1(-)组逆转更明显,差异有统计学意义,(P<0.05)。而Vimentin m RNA的表达增加被逆转,差异有统计学意义,(P<0.05)。WB检测相关蛋白表达,在TGF-β1(+)中,干扰ZEB2后CRB3蛋白及E-Cadherin蛋白表达量增加,而Vimentin蛋白表达量降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。在TGF-β1(-)中同样发现干扰ZEB2后CRB3蛋白及E-Cadherin蛋白表达量增加,而Vimentin蛋白表达量降低,且差异有统计学意义(P<0.05),但TGF-β1(+)与TGF-β1(-)比较中发现TGF-β1(+)组中CRB3蛋白及E-Cadherin蛋白表达量增加较TGF-β1(-)组增加明显,且差异有统计学意义(P<0.05),而TGF-β1(+)组较TGF-β1(-)组Vimentin蛋白表达量降低明显,差异有统计学意义(P<0.05)。5、干扰ZEB2后侵袭试验结果显示,LV-NC-si RNA组(Ca ES-17)穿膜细胞数为194.7±15.8,LV-ZEB2-si RNA组穿膜细胞数为92.0±7.2,后者的细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1+LV-NC-si RNA组(Ca ES-17)穿膜细胞数为252.7±8.0,TGF-β1+LV-ZEB2-si RNA组穿膜细胞数为152.0±4.0,后者的细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1(+)与TGF-β1(-)穿膜细胞数增加,差异有统计学意义(P<0.05)。下调ZEB2后细胞划痕法实验结果显示:24小时和48小时后检测发现,LV-NC-si RNA组与LV-ZEB2-si RNA组相比,细胞愈合速度明显降低差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1+LV-ZEB2-si RNA组细胞与LV-ZEB2-si RNA组相比,细胞愈合速度明显降低,差异具有统计学意义,(P<0.05)。6、过表达ZEB2后荧光定量PCR检测各组细胞CRB3 m RNA、E-Cadherin m RNA和Vimentin m RNA表达水平,结果显示无论是否TGF-β1诱导,ZEB2过表达后CRB3m RNA及E-Cadherin m RNA表达量降低,而Vimentin m RNA表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05),但TGF-β1诱导组较无TGF-β1诱导组E-Cadherin m RNA及CRB3 m RNA表达降低明显,而Vimentin m RNA表达量增加更明显,差异有统计学意义(P<0.05),WB检测过表达ZEB2后无论是否TGF-β1诱导,ZEB2过表达后CRB3及E-Cadherin表达量降低,而Vimentin蛋白表达量增加,但TGF-β1(+)与TGF-β1(-)CRB3、E-Cadherin蛋白表达降低明显,差异有统计学意义(P<0.05),而Vimentin蛋白表达量增加更明显(P>0.05)。7、过表达ZEB2后侵袭试验结果显示,pc DNA3.1(+)组(kyse140)穿膜细胞数为94.4±5.7,pc DNA3.1(+)/ZEB2组穿膜细胞数为219.0±7.2,后者的细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1+pc DNA3.1(+)组穿膜细胞数为162±7.0,TGF-β1+pc DNA3.1(+)/ZEB2组穿膜细胞数为252.0±6.0,后者的细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1(+)组与TGF-β1(-)组穿膜细胞数增加,差异有统计学意义(P<0.05)。过表达ZEB2后细胞划痕法实验结果显示:24小时和48小时后检测发现,pc DNA3.1(+)组与pc DNA3.1(+)/ZEB2组相比,细胞愈合速度明显降低(P<0.05);pc DNA3.1(+)/ZEB2组与TGF-β1+pc DNA3.1(+)/ZEB2组相比,细胞愈合速度明显降低(P<0.05)。8、在体水平,裸鼠肺大体标本和病理切片观察提示pc DNA3.1(+)/ZEB2细胞组肺转移瘤成瘤率为4/5,而pc DNA3.1(+)细胞组大体及显微镜下均未见肺转移灶,二者间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.食管鳞癌组织中存在ZEB2的高表达和E-cadherin的低表达,二者呈负相关,且ZEB2是影响食管鳞癌预后的独立因素。2.在食管癌组织中ZEB2的高表达与肿瘤浸润深度、肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移及预后相关,E-cadhedn在食管癌组织中的表达与淋巴结转移相关,两者异常表达可能在食管癌恶性进展及侵袭转移中有重要意义。3.在食管癌细胞株中ZEB2呈高表达,而E-cadherin呈低表达,且二者呈负性相关,ZEB2可能通过抑制E-cadherin的表达来促使EMT发生。4.在食管癌Ca ES-17和kyse140细胞中TGF-β1可以诱导EMT的发生。5.干扰ZEB2可使TGF-β1刺激导致的E-cadherin和上皮极性蛋白CRB3表达减少被逆转;而间皮标志物Vimentin的表达增加被逆转。可以抑制食管鳞癌Ca ES-17细胞的侵袭、迁移运动能力,可能在肿瘤细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用。6.过表达ZEB2可使TGF-β1刺激导致的E-cadherin、上皮极性蛋白CRB3表达下降更明显,而间皮标志物Vimentin的表达却增加。可以促进食管鳞癌kyse140细胞的侵袭、迁移运动能力,可能在恶性肿瘤细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用。7.ZEB2可能通过调节上皮极性蛋白CRB3来改变细胞极性,促进肿瘤的侵袭和转移。