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“天人相应”是中医学的基本特征,藏象学说是中医理论的核心组成部分,“四时五脏阴阳”理论是依据“天人相应”理论,从时间角度出发,来研究自然环境、季节变化、阴阳消长对机体生理、病理的影响及其规律性,从而探求藏象本质的一个学说。1目的以“四时五脏阴阳”为研究突破口,以褪黑素为研究切入点,以下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-甲状腺为研究主线,通过对“四时五脏阴阳”理论内涵的分析,选取对机体具有整体调控作用的下丘脑-垂体-肾上腺轴进行其与中医肾藏象实质的关系探讨,结合动物实验对下丘脑-垂体-肾上腺/甲状腺轴各层次相关激素水平、褪黑素及其受体、细胞信号转导四季变化的相关研究,进一步探讨“时脏相应”的科学性。2方法2.1理论研究本文采用文献资料法,对中医“四时五脏阴阳”理论内涵以及时令季节对机体生理、病理的影响加以阐述和分析,并将肾上腺轴与中医脏腑的关系进行探讨,为实验提供可行性理论依据。2.2实验研究2.2.1总体设计研究以自然环境时令气候为切入点,选取对光周期敏感的金黄地鼠(叙利亚仓鼠)为实验动物,观察生理状态、不同时令季节气候条件下,血清及下丘脑-垂体-肾上腺轴各组织中相关激素—促肾上腺皮质激素释放(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT),以及褪黑素(MT)、褪黑素受体(MR), AC-cAMP-PKA通路及原癌基因c-fos、c-jun水平的变化；肾上腺组织中褪黑素合成限速酶芳基烷化胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase, AANAT)、羟基吲哚-氧-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase, HIOMT)的活性变化；血清及甲状腺组织中下丘脑-垂体-甲状腺轴相关激素—促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素(TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4),以及MT、MR的水平变化,从而探讨时令季节对机体神经-内分泌-免疫的影响。2.2.2实验动物健康雄性金黄地鼠,(130±10)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。分别于春分、夏至、秋分、冬至前2周购入,每组8只。饲养条件：自然光照,湿度50%-70%,室温冬季(18±2)℃,夏季(25±2)℃。分别于春分、夏至、秋分、冬至傍晚将动物移至暗室,当晚22：00开始取材。2.2.3指标检测下丘脑-垂体-肾上腺轴血清及相应组织中MT、MR、CRH、ACTH. COR水平,肾上腺组织中褪黑素合成限速酶AANAT、HIOMT的活性,下丘脑-垂体-甲状腺轴血清及甲状腺组织中MT、MR、TRH、TSH、T3、T4的水平,下丘脑-垂体-肾上腺轴各组织中cAMP、PKA含量,以上指标均用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法；采用原位杂交法测定下丘脑-垂体-肾上腺轴各组织中原癌基因c-fos、c-jun mRNA水平。2.2.4分析、统计方法所有数据用均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 20.0统计软件分析。组间采用单因素方差分析或K个独立样本的非参数检验方法；两两比较时,用独立样本t检验,或2个独立样本的非参数检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。3结果3.1下丘脑-垂体-肾上腺轴相关激素的季节性变化金黄地鼠在生理条件下,其血浆、下丘脑、肾上腺组织中,MT、MR含量呈现春、冬高而夏至低的改变(p<0.05); CRH/CORT无论在血浆还是下丘脑/肾上腺组织中的含量均呈现冬、春高而夏至低(P<0.05)；ACTH在血浆中亦是春冬高、夏至最低(P<0.01)；垂体组织中,MT、MR及ACTH的含量呈现明显夏至高于冬至的规律(P<0.01)。3.2下丘脑-垂体-肾上腺轴第二信使cAMP、PKA含量的季节性变化下丘脑组织中cAMP、PKA含量的四时比较,均呈现冬、春高而夏至最低的一致性趋势,与垂体组织中PKA含量的四时趋势相同,但垂体中cAMP含量比较呈现夏秋高而春冬低的趋势；肾上腺组织中cAMP、PKA含量四时比较,均呈现春分最高、冬至次之而秋分最低的规律(P<0.05)。3.3下丘脑-垂体-肾上腺轴第三信使c-fos、c-jun mRNA的季节性变化c-fos mRNA平均光密度(MOD)表现为下丘脑组织中春夏高而秋冬较低,垂体组织中秋冬较高、春夏较低,肾上腺组织中秋夏较高、冬春较低；c-jun mRNA的MOD表现为下丘脑、垂体组织中均为秋冬较高、春夏较低,肾上腺组织中则为春冬高、夏秋低(P<0.05)。3.4肾上腺组织中褪黑素合成限速酶AANAT、HIOMT活性的季节性变化生理状态的金黄地鼠在自然四时条件下,其肾上腺组织中AANAT、HIOMT的含量均呈现春分最高、冬至次之而夏至最低的趋势,且四时之间对比均具有显著性差异(P<0.05)。3.5下丘脑-垂体-甲状腺轴相关激素的季节性变化血浆中MT、TRH、TSH、T3、L4含量四时比较,均呈现冬、春/秋高而夏至最低的趋势；甲状腺组织中MT、MR、T3、T4含量相比较显示,则均呈现夏至最高、秋冬最低的趋势。以上对比,最高与最低季节含量对比均存在显著性差异(P<0.01)。4结论4.1中医学“四时五脏阴阳”理论存在着生物学基础；4.2神经内分泌系统(下丘脑-垂体-甲状腺轴、下丘脑-垂体-肾上腺轴)的功能及相应细胞信号转导均存在着季节性变化的特点,与褪黑素的分泌调节有一定关系。