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背景前列腺癌已成为目前危害男性健康的常见恶性肿瘤之一，它的早期准确诊断是决定患者预后的关键，因此寻找一种早期诊断前列腺癌的影像学方法是目前临床上亟待解决的难题。超声分子影像学为前列腺癌的早期诊断提供了一种新的方法。构建能穿过前列腺癌肿瘤血管，进入肿瘤组织，并与前列腺癌细胞特异性结合的靶向超声微泡是实现前列腺癌超声分子靶向显影的两个重要环节。已有研究证实[1]，粒径小于1000nm的纳米微泡具有穿透力强、能聚集成像、性能稳定等优点。在疾病(如肿瘤)状态中，血管的内皮间隙扩大，缺乏基底膜和平滑肌结构，导致血管通透性明显升高，管壁的最大孔径约380～780nm，且肿瘤周围的淋巴循环不良，肿瘤的这种EPR(enhancedpermeation and retention)效应为纳米微泡实现肿瘤血管外基质和肿瘤实质细胞的分子显像和靶向治疗提供了理论依据[2-3]。同时前列腺特异性膜抗原(prostate-specificmembrane antigen，PSMA)位于前列腺细胞膜上,是一种前列腺癌尤其是转移性癌及激素难治性前列腺癌高度相关的生物学标志和诊治靶点，已成为前列腺癌特异性免疫定位显像诊断和免疫导向治疗的最有意义的靶蛋白。目前尚未见有关PSMA抗体靶向的纳米微泡的构建及其靶向分子显影的研究。因此，结合上述研究进展，针对目前前列腺癌诊断中的问题和难点，我们拟构建一种小型的、以PSMA抗体为靶向的纳米超声微泡，该微泡能穿过肿瘤血管进入组织间隙、与前列腺癌细胞特异性靶向结合，从而实现前列腺癌组织特异性显像，为前列腺癌的靶向分子显影提供新的方法和研究基础。研究目的制备PSMA单克隆抗体靶向的纳米超声微泡，检测其基本特性和与前列腺癌细胞的靶向结合能力；并探讨其在裸鼠前列腺癌移植瘤中的特异增强显像效果，为靶向纳米超声微泡前列腺癌特异性地超声分子显像和靶向治疗提供研究基础。方法1.应用细胞免疫荧光法定位PSMA在前列腺癌细胞(LNCaP、C4-2)和胃癌细胞(MKN45)上的表达。2.分别采用静电吸附法和生物素-亲和素桥联法(Avidinbiotin complex, ABC)制备PSMA单克隆抗体靶向的纳米微泡，检测其物理性状；免疫荧光法鉴定靶向纳米微泡表面抗体结合效果；光镜下观察其对前列腺癌LNCaP和C4-2细胞的靶向能力，用MKN45胃癌细胞对照；对比分析两种靶向纳米微泡的粒径、浓度、与前列腺癌细胞结合能力。3.建立前列腺癌细胞(LNCaP、C4-2)和胃癌细胞(MKN45)三种裸鼠移植瘤模型，用PHILIPS iU22超声诊断仪检测生物素-亲和素桥联法制备的靶向纳米微泡与空白纳米微泡在前列腺癌细胞荷瘤裸鼠、胃癌细胞荷瘤裸鼠上的增强显影效果，用PHILIPSQLab8.1软件对数据进行定量分析，对比研究靶向纳米微泡和空白纳米微泡在三种移植瘤中的开始显影时间、达峰时间、峰值强度及增强显影持续时间。并进一步分析靶向纳米微泡在三种移植瘤中开始显影时间、达峰时间、峰值强度及增强显影持续时间的差异。结果1．荧光显微镜下可见前列腺癌(LNCaP、C4-2)细胞膜呈现明显的绿色荧光，而对照组胃癌细胞(MKN45)细胞膜无明显绿色荧光。2．光镜下观察两种靶向纳米微泡呈圆形，表面光滑，大小均匀，分散度好无聚集，检测其粒径小于1000nm，经二抗孵育后荧光显微镜下可见靶向纳米微泡表面发出明亮的绿色荧光，在体外细胞寻靶实验中可见靶向纳米微泡在前列腺癌细胞LNCaP、C4-2表面规律排列，而在胃癌细胞MKN45表面未见靶向纳米微泡结合。空白纳米微泡与三种细胞均无黏附。其中静电吸附法制备的靶向纳米微泡平均粒径为(702.96±66.65) nm，平均浓度为(3.46±0.3)×108个/ml，适应于pH4.6的溶液中，与前列腺癌细胞LNCaP黏附率(77.2±3.19)%，C4-2细胞黏附率(61±4.47)%；生物素-亲和素桥联法制备的靶向纳米微泡平均粒径为(609.90±37.40) nm，平均浓度约(4.52±0.19)×108个/ml，与前列腺癌细胞LNCaP黏附率(96.6±1.14)%，C4-2细胞黏附率(94±1.58)%。两种靶向纳米微泡的粒径、浓度及细胞黏附率比较，均有统计学差异。3．成功建立三种裸鼠移植瘤模型，在前列腺癌细胞LNCaP及C4-2移植瘤中，生物素-亲和素桥联法制备的靶向纳米微泡与空白纳米微泡相比，在开始显影时间及达峰时间上无显著差异(P>0.05)，而在峰值强度及增强显影持续时间上均有显著差异(P<0.05)。在胃癌细胞MKN45移植瘤中，两种纳米微泡在开始显影时间、达峰时间、峰值强度及增强显影持续时间上均无差异(P>0.05)。靶向纳米微泡在三种移植瘤中的开始显影时间，达峰时间无差异(P>0.05)，而峰值强度及增强显影持续时间上有差异(P<0.05)。结论1.细胞免疫荧光法表明LNCaP、C4-2细胞膜高表达PSMA，而MKN45细胞膜不表达PSMA，可见PSMA具有前列腺癌细胞特异性。2.静电吸附法和生物素-亲和素桥联法均能成功制备了PSMA单克隆抗体靶向的纳米微泡，均能特异性结合前列腺癌细胞LNCaP、C4-2，而对胃癌细胞MKN45无靶向性结合。其中，生物素-亲和素桥联法制备的靶向纳米级微泡与静电吸附法制备的靶向纳米级微泡相比，粒径小，浓度大，与前列腺癌细胞结合的能力更强。3. PSMA抗体靶向的纳米微泡能较空白纳米微泡显著增强前列腺癌移植瘤增强显影的峰值强度和增强显影持续时间，其中，峰值强度的增强和增强显影持续时间的延长是靶向纳米微泡在体内成像的主要特征,表明本研究所制备的靶向纳米微泡在裸鼠前列腺癌移植瘤中具有较高的靶向能力及良好的增强显影效果，为前列腺癌的早期诊断提供了一种新思路。