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骨癌包括原发性骨癌和转移性骨癌,其中,最为常见的是乳腺癌、前列腺癌、肺癌晚期的骨转移。骨癌痛是最严重的癌痛之一。骨癌条件下,肿瘤细胞、成纤维细胞、炎症细胞以及成骨和破骨细胞可以产生并分泌多种蛋白酶、细胞因子和趋化因子等,构成独特的肿瘤微环境。这些物质可能通过兴奋并敏化伤害感受器,引起外周敏化。MMP-9是基质金属蛋白酶家族中研究最多的成员之一,它可以分解细胞外基质成分(如胶原、明胶),激活细胞因子和生长因子(如TNFα、TGF-β、IL-1β)等。MMP-9在组织中低表达,基质重塑需要时表达增加。MMP-9合成、分泌和活化发生异常会产生病理性作用,如炎症、神经变性疾病,以及炎症痛、神经病理痛和癌症痛等。MMP-9在骨癌痛中的变化和作用如何,目前尚不清楚。TRPV1是一种非选择性阳离子通道,可被伤害性热、H+、辣椒素、内源性脂类等刺激激活。TRPV1主要表达在DRG小直径神经元,是一种重要的痛觉信息分子整合器。已知TRPV1参与炎症痛、神经病理痛,并且在癌症痛中发挥重要作用。TNFa是一种重要的促炎性细胞因子,以跨膜前体的形式分布在细胞表面,被活化后形成同源三聚体活性形式,主要与受体TNFR1结合。TNFa在病理条件下大量表达,并且参与炎症痛、神经病理痛、癌症痛等。TNFa可以通过调节TRPV1、Na+通道、K+通道、Ca2+通道等多种离子通道,参与伤害感受器敏化。本研究在大鼠胫骨骨髓腔接种Walker 256乳腺癌细胞建立的骨癌痛模型上,采用免疫组织化学、明胶酶谱法、Western blot、行为学和电生理学等方法,对骨癌痛发生、发展过程中,外周MMP-9、TRPV1和TNFα的表达分布、动态变化及其在骨癌痛中的作用进行了初步探索。主要结果如下：1.骨癌痛发展过程中,外周MMP-9、TRPV1和TNFα的动态变化骨癌痛造模后第7天、14天、21天,肿瘤患侧骨组织中MMP-9的蛋白表达水平和活性明显增加,第7天上调最明显。骨癌第7天、14天、21天,患侧DRG神经元中MMP-9、TRPV1通道的蛋白表达水平明显上调,第7天上调最明显。TNFα活性形式在骨癌第7天明显上调,第14天和21天恢复到正常水平。2.外周MMP-9参与骨癌痛肿瘤周围深部组织注射或鞘内注射MMP-9内源性抑制物TIMP-1可以缓解骨癌7天已形成的机械触诱发痛和热痛敏。鞘内慢性给予MMP-9合成抑制剂MMP-9 inhibitor I可以延缓骨癌痛的进程。3.MMP-9敏化DRG神经元TRPV1通道并诱发机械触诱发痛和热痛觉过敏免疫组化结果显示,MMP-9与TRPV1在DRG神经元有很好的共标,骨癌大鼠患侧DRG神经元中的MMP-9和TRPV1阳性细胞比例均明显上调。电生理结果表明,MMP-9可以敏化DRG神经元TRPV1通道,并使已经脱敏的TRPV1通道复敏。C57野生小鼠足底皮下注射MMP-9可以诱发机械触诱发痛和热痛觉过敏,TRPV1敲除小鼠足底皮下给予MMP-9则不能引发机械触诱发痛和热痛觉过敏。提示MMP-9的致痛作用是通过TRPV1通道实现的。4. TNFa介导MMP-9对TRPV1通道的敏化作用Westernblot结果显示,急性分离的DRG神经元孵育MMP-90.5h后,TNFa活性形式和TRPV1通道的表达均上调。足底皮下注射MMP-9在TNFR1受体敲除的小鼠上不能诱发机械触诱发痛和热痛觉过敏。提示TNFα前体可能作为MMP-9的底物参与MMP-9对TRPV1的敏化和致痛作用。综上所述,本研究显示,在Walker 256大鼠乳腺癌细胞引起的骨癌痛模型中,肿瘤骨组织部位和DRG神经元释放大量的MMP-9,可作用于DRG初级感觉神经元上的TNFα前体使之活化并与TNFR1受体结合,继而使TRPV1通道的表达和敏感性增加,参与骨癌痛的发生和发展。本研究提示,外周MMP-9可能是治疗骨癌痛的重要靶点。