论文部分内容阅读
第一部分PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγt在子痫前期患者胎盘组织中表达的研究目的：通过检测PD-1与其配体PD-L1,以及Treg和Th17细胞的特异性核转录因子Foxp3和RORγt在子痫前期患者和正常孕妇胎盘组织中的表达水平及其差异,探讨PD-1/PD-Ll信号通路在子痫前期发病机制中的作用。方法：以正常晚孕妇女为对照组(n=16),临床确诊为子痫前期的患者为研究对象(n=10)。收集两组孕妇的胎盘,采用免疫组化法检测胎盘中PD-1、PD-L1、 Foxp3和RORγt蛋白的表达,荧光定量PCR法和Western blot法分别检测胎盘中PD-1、PD-L1、Foxp3和RORyγt mRNA和蛋白表达水平。结果：1.PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγ蛋白在子痫前期患者和正常孕妇的胎盘组织中均有表达,PD-1和PD-L1主要位于胎盘绒毛滋养细胞中,主要在细胞浆和细胞膜中表达；Foxp3和RORγt主要位于胎盘绒毛滋养细胞及绒毛间质细胞中,主要在细胞核和细胞浆中表达。2.与正常妊娠组相比,子痫前期组胎盘中PD-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PD-L1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),Foxp3 mRNA表达水平明显降低(P<0.01),RORγt mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。3.与正常妊娠组相比,子痫前期组胎盘中PD-1蛋白表达量明显降低(P<0.01),PD-L1蛋白表达量明显降低(P<0.01),Foxp3蛋白表达量明显降低(P<0.01),RORγt蛋白表达量明显升高(P<0.01)。结论：胎盘组织中PD-1和PD-L1主要表达于绒毛滋养细胞,子痫前期患者胎盘中Foxp3表达水平明显降低,RORγt表达水平明显升高,提示Treg/Th17免疫失衡可能在子痫前期中发挥作用,PD-1和PD-L1表达水平的下降可能与子痫前期的发生有关。第二部分PD-L1 Fc活化PD-1/PD-L1信号通路对子痫前期样大鼠的治疗效应及分子机制研究目的：采用一氧化氮合成酶抑制剂-亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NG-Nitroarginine Methyl Ester, L-NAME)建立子痫前期样大鼠模型,从孕鼠血压、尿蛋白、体重增长、肝肾功能、外周血及胎盘中Treg/Th17细胞平衡的改变和子代结局等方面评价PD-L1 Fc融合蛋白在治疗子痫前期样大鼠中的疗效,并进一步探讨其作用机制。方法：1.将20只SD雌鼠随机分为4组：正常妊娠组、子痫前期样组、硫酸镁(MgSO4)治疗组及PD-L1 Fc治疗组,每组5只大鼠。后三组分别给予皮下注射L-NAME建立子痫前期样大鼠模型。在妊娠第16天,分别给予前两组生理盐水,后两组分别给予MgSO4和PD-L1 Fc融合蛋白,均为皮下注射给药方式。2.在大鼠妊娠前、妊娠后隔日采用无创大鼠尾动脉测压仪测量大鼠血压,收集妊娠前,妊娠第10、17、20天的24小时尿液进行尿蛋白定量分析；从妊娠第2天开始,每隔一日称量大鼠体重,至妊娠第21天。3.妊娠第21天,取母鼠肝肾组织,进行HE染色及分析；取母鼠脾脏,采用流式细胞技术检测脾脏淋巴细胞中Treg和Th17细胞的数量。4.免疫荧光法检测胎盘Foxp3、RORγt蛋白的表达。5.荧光定量PCR及Western blot法检测PD-1/PD-L1信号通路相关分子mRNA及蛋白的表达。6.计数仔鼠数量和胚胎吸收率,称量仔鼠及胎盘重量,测量仔鼠体长。结果：1.正常妊娠组大鼠在整个孕期收缩压较稳定,妊娠第16天为116.0±1.581 mmHg;大鼠注射L-NAME后收缩压升高,妊娠第16天时为138.8 ±1.643 mmHg,明显高于正常妊娠组(P<0.001)。子痫前期样组的收缩压从妊娠第14天开始一直持续高位到妊娠结束,MgSO4治疗组和PD-L1 Fc治疗组的收缩压在治疗后下降,MgSO4的治疗效果迅速但短暂,PD-L1 Fc的治疗效果稳定且持久,降压效果可持续到妊娠第18天。2.注射L-NAME后,子痫前期样大鼠的尿蛋白明显升高(P<0.001),MgSO4治疗对此无明显改善作用,经过PD-L1 Fc治疗后,大鼠在妊娠第20天时尿蛋白水平明显降低(P<0.05)。与正常妊娠组相比,子痫前期样大鼠组在妊娠期间体重增长减少(P<0.05),PD-L1 Fc治疗后体重增长有相对升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。子痫前期样大鼠的肝肾病理损伤评分相比正常妊娠组均显著升高(P<0.001,P<0.001),PD-L1 Fc治疗组的肝肾病理损伤评分相比其他造模组均明显下降。3.与正常妊娠组相比,子痫前期样大鼠组外周中Treg细胞比例明显下降(P<0.01),Th17细胞比例明显增加(P<0.01),Treg/Th17比例明显下降(P<0.01),PD-L1Fc治疗后Th17细胞比例明显降低(P<0.01),Treg/Th17比例明显上升(P<0.01)。4.免疫荧光结果显示Foxp3、RORyt蛋白在胎盘上均有表达,与子痫前期样大鼠组相比,PD-L1 Fc治疗组胎盘上Foxp3 mRNA表达水平升高(P<0.05),RORyt mRNA表达量降低(P<0.01), PD-1、PD-L1 mRNA表达水平也分别升高(P<0.05,P<0.05)。PD-L1 Fc治疗后,PI3K/AKT/mTOR mRNA表达水平下降,PTEN mRNA表达水平升高。蛋白检测结果显示上述分子的蛋白水平变化与mRNA表达水平变化一致。5.子痫前期样大鼠的仔鼠表现为：肢体畸形,体重较轻,体长较短。与正常妊娠组相比,子痫前期样大鼠的胚胎吸收率明显增加(P<0.01),PD-L1 Fc对仔鼠发育的影响主要表现为仔鼠体重和体长有增加趋势,胚胎吸收率下降,与正常妊娠组相比无明显差异,胎盘重量明显增加(P<0.05)。结论：PD-L1 Fc融合蛋白可以改善L-NAME诱导的子痫前期样大鼠模型的临床症状,且治疗效果优于传统治疗药物MgSO4。PD-L1 Fc融合蛋白可以逆转大鼠外周和胎盘局部Treg/Th17细胞免疫失衡,这种调控作用主要通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进PTEN的表达实现。此外,PD-L1 Fc融合蛋白表现出对胎儿发育的保护性作用,提示其有潜在的治疗子痫前期的价值。第三部分PD-1/PD-L1信号通路对子痫前期患者外周血初始CD4+T细胞分化的影响研究目的：通过激活或阻断PD-1/PD-L1信号通路,在不同干预条件下与初始CD4+T(Naive CD4+T)细胞共培养,以阐明PD-1/PD-L1通路对Naive CD4+T细胞分化为Treg和Thl7细胞的影响及作用机制。方法：采集正常晚孕妇女(n=15)和子痫前期患者(n=15)的外周血,采用免疫磁珠法分选出外周血中Naive CD4+T细胞,分别在Th0、Treg和Th17免疫环境下,单独培养或与PD-L1 Fc融合蛋白或anti-PD-L1 mAb共培养,采用荧光定量PCR方法检测PD-1/PD-L1信号通路相关分子Foxp3、RORγt、PI3K、AKT、m-TOR和PTEN mRNA的表达水平。结果：1.正常妊娠组中,在Th0培养条件下,Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高(P<0.05),在加入anti-PD-L1 mAb后明显降低(P<0.05);在Th17培养条件下,Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高(P<0.001),在加入anti-PD-L1 mAb后无明显改变,相比Th17+PD-L1 Fc组表达水平明显下降(P<0.001)；在Treg培养条件下,加入PD-L1 Fc或anti-PD-L1 mAb后Foxp3 mRNA表达水平均无明显改变；子痫前期组中,在Th0培养条件下,Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高(P<0.05)：在Th17培养条件下,Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高(P<0.05)；在Treg培养条件下,加入PD-L1 Fc或anti-PD-L1 mAb后Foxp3 mRNA表达水平均无明显改变。2.正常妊娠组中,在Th0培养条件下,RORγt mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显降低(P<0.05),在加入anti-PD-L1 mAb后表达水平明显升高(P<0.05);在Th17培养条件下,加入PD-L1 Fc后RORyt mRNA表达水平明显下降(P<0.05);在Treg培养条件下,RORyt mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高(P<0.05)；子痫前期组中,在Th0培养条件下,RORyt mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高(P<0.001)；在Th17及Treg培养条件下,RORyt mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。3.正常妊娠组中,在Th0培养条件下,加入PD-L1 Fc后PI3K、AKT、m-TOR mRNA表达水平分别明显降低(P<0.05,P<0.05,P<0.05),PTEN mRNA表达量升高(P<0.05),PTEN mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显降低(P<0.01)；在Th17培养条件下,加入PD-L1 Fc后AKT mRNA表达水平显著下降(P<0.05);在Treg培养条件下,加入anti-PD-L1 mAb后m-TOR mRNA表达水平明显升高(P<0.05)；子痫前期组中,在Th0培养条件下,加入PD-L1 Fc后AKT mRNA表达水平明显降低(P<0.05),加入anti-PD-L1 mAb后PI3K、AKT、 m-TOR mRNA表达水平分别明显上升(P<0.01,P<0.05,P<0.01);在Th17培养条件下,PI3K mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高(P<0.01);在Treg培养条件下,加入PD-L1 Fc后, PTEN mRNA表达量明显升高(P<0.01)。结论：在不同培养条件下,加入PD-L1 Fc后Foxp3 mRNA表达水平明显升高,RORyt mRNA表达水平明显降低,加入anti-PD-L1 mAb后Foxp3 mRNA表达水平明显降低,RORyt mRNA表达水平明显升高,提示PD-L1 Fc融合蛋白促进Naive CD4+T细胞向Treg细胞分化,anti-PD-L1 mAb促进Naive CD4+T细胞向Th17细胞分化,这两种效应分别是通过激活或抑制PD-1/PD-L1信号通路,调控信号通路相关分子PI3K、AKT、m-TOR和PTEN的表达实现。