成骨肉瘤发生率相对较低,但在原发性恶性骨肿瘤中占首位。该病在青少年中发病率高,且死亡率和致残率高,严重影响青少年健康。成骨肉瘤对放射治疗不敏感,目前采用大剂量化疗结合手术治疗的方式。然而化疗药物易产生耐药性且有毒副作用,因此从天然化合物中筛选低毒、高效的抗癌药物用于临床治疗具有重要意义。苄基异喹啉类生物碱(benzylisoquinoline alkaloid, BA)是自然界中广泛存在的一类生物碱,具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒及抗血小板凝集、抗心律失常和抗高血压等心血管疾病的多种药理活性。研究表明多种BA对不同肿瘤细胞株均显示了较强的细胞毒作用。其抑制肿瘤细胞增殖的机制主要是诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。甲基莲心碱(Neferine)属于双苄基异喹啉类生物碱,是莲子心(睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn)成熟种子的绿色胚芽)中一种主要的生物碱成分。已有的研究表明甲基莲心碱具有降血压、抗氧自由基、抗心律失常、抗血小板凝集等多种药理作用；并且甲基莲心碱还是一种化疗增敏剂,能逆转肿瘤细胞的多药耐药性。化疗药物抑制肿瘤细胞生长的普遍机制在于抑制其细胞周期进程和／或促进细胞凋亡。本课题组的前期研究发现,甲基莲心碱能明显抑制人类成骨肉瘤细胞、乳腺癌细胞及宫颈癌细胞的生长。甲基莲心碱可诱导成骨肉瘤细胞G1期细胞周期停滞,cyclinE表达水平降低、p21蛋白水平升高,但并不引起细胞DNA损伤和细胞凋亡。然而,由于对甲基莲心碱抑制肿瘤细胞生长的分子生物学机制尚未见报道,这在一定程度上限制了其在临床医学中的应用,因此深入探讨甲基莲心碱抑制人成骨肉瘤细胞生长的可能的作用机制就有重要的意义。为进一步明确甲基莲心碱诱导成骨肉瘤细胞发生G1期停滞的分子机制,我们进行了以下的研究：●甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞细胞周期G1期停滞依赖于p21蛋白的累积由于前期研究结果提示甲基莲心碱诱导成骨肉瘤细胞G1期停滞、p21蛋白累积,因此有必要验证p21蛋白累积是否是甲基莲心碱引起成骨肉瘤细胞G1期阻滞的直接原因。1.我们采用siRNA干扰p21基因表达的方法,检测甲基莲心碱处理后U20S细胞内p21表达情况和细胞增殖能力。结果发现：与对照细胞相比,低表达p21基因的细胞经甲基莲心碱处理后,p21蛋白的累积明显减弱,并部分抵消甲基莲心碱引起的S期细胞比例降低的效应,这表明甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞细胞周期G1期停滞依赖于p21蛋白的累积。2.进一步明确甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞的p21蛋白水平上调是否为转录水平调控。(1)实时定量PCR方法检测甲基莲心碱处理前后U20S细胞内p21mRNA水平,结果提示,不同浓度甲基莲心碱(5,10,20μ M)处理U20S细胞,与对照细胞相比,p21mRNA水平并没有显著的变化；提示甲基莲心碱不是通过转录水平激活p21的表达。(2)为进一步明确甲基莲心碱激活p21的机制,我们用CHX抑制新蛋白质合成,检测甲基莲心碱处理前后p21蛋白质半衰期的变化,结果表明与未处理细胞相比,甲基莲心碱可明显延长p21蛋白半衰期,蛋白降解延迟。初步说明甲基莲心碱从翻译后水平调控p21蛋白的表达水平。●甲基莲心碱诱导p21蛋白的累积对相关信号通路的影响多项研究发现MAPK和AKT信号通路参与调控p21蛋白累积及细胞周期G1期停滞过程。许多化疗药物抑制肿瘤细胞生长的过程中,也伴随着MAPK、AKT等信号通路的激活。为了进一步明确甲基莲心碱诱导p21蛋白累积和细胞周期G1期停滞的分子机制,以及涉及到的信号通路,我们采用western blotting实验检测了ERK、AKT、p38MAPK和JNK1/2四种分子的磷酸化水平,并用抑制激酶活性、RNAi干扰等方法探讨了JNK1/2和p38MAPK在甲基莲心碱诱导p21蛋白累积过程中的作用。1.10μM甲基莲心碱能够显著激活P38MAPK和JNK1/2通路,而对ERK、AKT通路则没有明显影响。实验结果提示P38MAPK、JNK1/2可能参与甲基莲心碱诱导的p21蛋白的累积和细胞周期G1期阻滞,而ERK、AKT不参与调控该过程。2.JNK1/2对甲基莲心碱诱导p21累积的影响：(1)为了明确JNK1/2信号通路是否参与甲基莲心碱诱导p21的累积,采用JNK1/2活性抑制剂SP600125特异性抑制U20S细胞的JNK1/2激酶活性后,检测细胞内p21蛋白的表达水平,结果显示,阻断JNK并没有引起p21蛋白水平的降低,p21蛋白反而明显增加；初步说明JNK并不参与甲基莲心碱诱导p21的累积。(2)为了进一步明确JNK信号通路对甲基莲心碱诱导p21累积的影响,利用siRNA干扰U20S细胞JNK1/2基因表达,发现抑制JNK1/2基因可上调细胞内p21蛋白水平,并且不能抑制甲基莲心碱诱导的p21累积；提示在U20S细胞中JNK信号通路有下调p21蛋白水平的作用。3. p38MAPK信号通路对甲基莲心碱诱导p21累积的影响：(1)为阐明p38MAPK信号通路是否参与甲基莲心碱诱导p21表达的增加,利用p38MAPK活性抑制剂SB203580特异性抑制U20S细胞的p38MAPK激酶活性后,检测p21的表达水平。结果显示：与对照细胞相比,SB203580明显抑制了甲基莲心碱诱导p21蛋白水平的增加。这提示甲基莲心碱引起的p21蛋白累积依赖于p38MAPK信号通路的激活。(2)为进一步验证p38MAPK信号通路在甲基莲心碱引起的p21蛋白累积过程中的作用,利用RNAi技术抑制U20S细胞p38α、β基因表达水平后,检测p21蛋白表达水平。结果表明甲基莲心碱诱导的p21蛋白的累积效应在p38干扰的细胞中明显减弱；BrdU掺入实验证实低表达p38MAPK基因也逆转了甲基莲心碱引起细胞增殖能力的降低。以上实验结果说明甲基莲心碱诱导p21蛋白累积依赖于p38MAPK信号通路的激活。4.明确p38MAPK介导甲基莲心碱诱导p21蛋白累积的分子机制：(1)分析p38MAPK对p21蛋白质半衰期的影响：为研究P38MAPK对甲基莲心碱诱导p21累积的具体机制,采用CHX抑制新蛋白质合成,检测阻断p38MAPK通路后p21蛋白的半衰期。分析实验结果发现,甲基莲心碱明显延长U20S细胞p21蛋白的稳定性,而当用SB203580抑制p38MAPK激酶活性后,SB203580可抑制由甲基莲心碱引起的p21蛋白半衰期的延长。这说明甲基莲心碱诱导的p21蛋白半衰期的延长依赖于P38MAPK信号通路的激活。(2)检测p38MAPK对p-p21Ser130的影响：p38MAPK主要通过磷酸化下游靶分子而发挥作用,为了进一步明确p38MAPK介导p21蛋白稳定性增加的机制,我们选择文献报道的可能与p38MAPK有关的p21蛋白的磷酸化位点进行检测。结果提示甲基莲心碱处理U20S细胞可诱导p21蛋白水平的累积,伴随有p21Ser130位点磷酸化程度升高；当用SB203580抑制p38激酶活性或利用siRNA干扰p38基因表达后,甲基莲心碱不再能够引起细胞内p21蛋白累积,并且p21Ser130位点磷酸化程度降低,实验结果说明激活的p38MAPK信号通路通过磷酸化p21Ser130位点并增加p21蛋白的稳定性,进而介导了甲基莲心碱诱导的细胞周期G1期停滞。本研究的实验结果表明,甲基莲心碱对成骨肉瘤细胞的生长抑制机制是通过诱导p21蛋白的累积而实现的,而p21蛋白的累积并不是发生在转录水平；进一步研究表明,甲基莲心碱激活p38MAPK信号通路,活化的p38MAPK信号通路通过磷酸化p-p21Ser130而延长p21蛋白半衰期,导致p21蛋白在细胞内累积进而引起细胞周期G1期停滞,抑制成骨肉瘤细胞的生长。