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猪呼吸道疾病是影响养猪业发展的主要疾病之一,是目前我国规模化猪场的常发病、多发病,已经引起人们的普遍重视,给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪流感病毒是最为多见的猪病毒性呼吸道疾病病原,且在临床上常呈混合或继发感染。猪群中,多病原混合感染已是疾病发生的普遍特点,两种或以上病原体共同感染导致猪群发病率和死亡率增高,使得疾病诊断和防治难度加大。为实现临床多病原混合感染的快速确诊,本研究建立了针对上述6种病毒的多重PCR鉴别诊断方法,为相关疫病的快速诊断和防控提供了有效的技术手段。主要研究内容如下:1、PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV的单项PCR/RT-PCR方法的建立参照NCBI中PRV g B（AF257079）、PCV2 ORF2（NC005148）、PRRSV ORF6（NC001961）、CSFV C（AY805221）、PPV NS1（NC001718）、SIV M（GU086140）等基因序列,应用相关软件各设计了1对特异性引物,分别用于扩增PRV g B基因、PCV2 ORF2基因、PRRSV ORF6基因、CSFV C基因、PPV NS1基因和SIV M基因的部分序列,扩增的目的片段大小分别为192bp、255bp、364 bp、530 bp、759 bp和981bp,通过对目的基因的测序鉴定以及反应的条件优化,建立了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV的单项PCR/RT-PCR方法,为摸索建立多重PCR方法的条件打下基础。2、三重PCR及三重RT-PCR鉴别诊断方法的建立与初步应用在建立的PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的单项PCR/RT-PCR方法的基础上,以阳性病毒核酸为模板进行多重PCR扩增及反应体系和反应条件的优化,分别得到与设计相符合的3条特异性条带,建立了能同时检测PRV、PCV2和PPV三种DNA病毒的三重PCR方法和能同时检测PRRSV、CSFV和SIV三种RNA病毒的三重RT-PCR方法。试验结果表明该方法具有较好的敏感性和特异性,且均在56℃时检测效果最好。该方法对临床病料的检测结果与单项PCR结果一致。3、猪呼吸道病毒性疫病多重PCR鉴别诊断方法的建立与初步应用在建立的三重PCR方法及三重RT-PCR方法的基础上,通过对多重PCR反应条件的优化,以及临床应用检测,成功建立了能同时检测PRV、PCV2、CSFV和SIV四种病毒的多重PCR方法,能同时检测PRV、PCV2、PRRSV、CSFV和SIV五种病毒的多重PCR方法,以及同时检测PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV六种病毒的多重PCR方法,敏感性试验表明,建立的多重PCR最低检测限均达到pg级水平,特异性结果表明均只能检测出目的条带,对其他病毒扩增结果呈阴性。该方法对48份临床病料的检测结果表明其能快速、准确地对病料进行检测。