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苯丙烷代谢途径是植物次生代谢产物合成中一条重要的生化途径,该途径以苯丙氨酸(Phenylalanine)和酪氨酸(Tyrosine)为底物,在苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸-4羟化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)等催化下,通过下游特异性分支途径,分别合成木质素、花青素、丹宁等次生代谢产物。这些次生代谢化合物在植物生长发育、抵御生物或非生物胁迫中起着重要的作用。比如,木质素作为细胞壁的重要组分,为植物提供机械支撑,并参与病害的防御;而花青素和丹宁等类黄酮化合物则在植物细胞抵御外来非生物胁迫(如紫外辐射)和生物胁迫(如抗病虫害)中扮演了重要角色。在草本植物中,已经证实苯丙烷代谢途径受到了NAC、MYB等许多转录因子的调控,而该途径在木本植物的转录调控机制研究还相对较少,因此,解析林木中苯丙烷代谢途径的转录调控机制对于阐明木质素及类黄酮等次生代谢产物合成代谢调控机理具有十分重要的意义。本文以杨树为研究对象,分别克隆了NAC和MYB家族转录因子Pto VNS11和PtoMYB156,对其在调控杨树次生壁合成和苯丙烷代谢途径中的生物学功能进行了系统研究,主要结果如下:(一)从毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中克隆到一个与拟南芥SND1高度同源的NAC家族转录因子编码基因PtoVNS11。该基因编码一个由416个氨基酸组成的蛋白,具有NAC家族转录因子保守的功能结构域。进化树分析显示,该蛋白与拟南芥和毛果杨中调控次生壁合成调控的关键转录因子SND1和PtrWND1B的序列相似性分别达59.6%和97.9%,而在NAC家族转录因子特有结构域(A~E结构域)中的氨基酸序列基本一致。推测PtoVNS11为SND1、PtrWND1B的同源基因,可能具有相似的生物学功能。实时定量PCR分析PtoVNS11基因组织表达谱发现,该基因在杨树茎的木质部中特异性表达,暗示其可能参与了对植物次生壁形成的调控。进一步将ptovns11融合gfp构建重组蛋白,亚细胞定位试验证明,ptovns11专一定位于细胞核中。酵母转录激活试验表明,ptovns11具有转录激活特性。同时,克隆ptovns11基因上游2069bp的启动子片段,融合gus报告基因,在转基因拟南芥中证实,该启动子能在营养及繁殖器官的维管组织中表达,且启动子内的snbe(secondarywallnacbindingelement)元件决定了gus基因的表达活性,暗示ptovns11可能调控了杨树维管组织的发育。为了搞清ptovns11的生物学功能,将其构建到由组成型表达启动子驱动的植物表达载体上,首先导入拟南芥snd1nst1双突变体中,发现该基因可恢复双突变体维管束间纤维及木质纤维形成受阻、茎杆倒伏等缺陷。在拟南芥中过量表达该基因,则引起了木质部细胞和表皮细胞次生壁的异位形成和木质素的过量沉积。上述结果与拟南芥snd1、nst1及ptrwnds基因的功能相似,证明ptovns11是杨树次生壁形成中木质素合成的“开关”基因。进一步在杨树中过量表达ptovns11,导致转基因植株茎中木质素含量增加。定量pcr分析显示,该基因的超表达激活了转基因杨树中一系列与次生壁合成相关的nac/myb转录因子和关键酶基因的表达。(二)在超表达ptovns11的转基因杨树中,ptomyb156的表达水平被明显下调,进化树分析发现ptomyb156与拟南芥myb4高度同源,而后者已被证实作为转录抑制子参与了拟南芥中木质素合成的调控。因此,推测杨树中的ptomyb156是位于ptovns11下游的负调控因子,可能参与了杨树次生壁的生物合成过程。为了解析ptomyb156转录因子的生物学功能,从毛白杨(p.tomentosacarr.)中克隆了该基因。亚细胞定位试验证明ptomyb156定位于细胞核中。启动子表达特性和实时定量pcr分析显示,ptomyb156不仅在毛白杨的茎、根、木质部和茎皮等表达水平较高,而且在叶片及叶柄等组织中含量也比较丰富。酵母单杂交试验证实ptomyb156具有转录抑制活性。为了进一步研究ptomyb156的生物学功能,构建了35s:ptomyb156超表达载体并转化,获得毛白杨转基因超表达株系。利用crispr/cas9靶向基因编辑技术,特异的敲除了毛白杨内源的ptomby156编码基因,获得了该基因功能缺失的突变体株系。观察发现ptomyb156过量表达引起杨树倒伏、叶片皱缩上卷,转基因杨树茎的直径、成熟叶叶面积及植株总生物量等相关生长指标下降。在分子水平上,多个次生壁形成相关的关键酶基因表达下调。而敲除该基因则导致木质部导管和纤维细胞次生壁厚度增加。同时引起木质素合成键酶基因表达显著上升。以上实验结果证明ptomyb156基因参与了杨树木质素生物合成途径的调控,进而影响了杨树次生壁的形成和次生木质部的发育。(三)为了阐明ptomyb156是否参与了杨树类黄酮合成途径中的调控,对ptomyb156转基因杨树中类黄酮合成途径中关键美的表达进行了分子检测,发现C4H,CHS,DFR等关键酶编码基因的表达被下调,暗示PtoMYB156可能负调控杨树中花青素、丹宁等类黄酮化合物的合成。为了进一步验证PtoMYB156的功能,将其在拟南芥中过量表达,发现转基因植株子叶卷曲、体型变小、种子种皮颜色呈浅黄色等表型。DMACA染色显示转基因种子中丹宁含量明显减少。UV-B辐射的抵抗试验证实转基因拟南芥的抵御能力减弱。HPLC检测显示两种类黄酮化合物——槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)和可溶性丹宁含量均明显下降。定量PCR分析显示参与单宁、槲皮素和山奈酚合成的关键酶基因表达量均有下调。烟草叶片瞬时共表达试验证明,PtoMYB156能抑制类黄酮合成途径关键酶LAR、FLS及次生壁合成途径中相关基因C4H、CesA17、GT43B的表达。上述结果表明,PtoMYB156通过调节类黄酮化合物的含量,降低了植物对UV-B辐射胁迫的防御能力,影响了拟南芥种皮中色素的累积。综上所述,本论文克隆了两个参与杨树次生壁发育及类黄酮合成调控的转录因子PtoVNS11和Pto MYB156,并通过转基因技术、基因敲除技术及组织化学等实验方法,阐明了其对杨树木质部次生壁形成的调控及对UV辐射胁迫响应能力的影响,揭示了两者参与调控苯丙烷代谢途径中多种次生代谢产物合成的分子机制,为杨树遗传改良奠定了理论基础。