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研究背景和目的:慢加急性肝衰竭(ACLF)是慢性肝病急性加重引起的一种危重症,常伴有多器官衰竭并具有短期内高死亡率。剧烈的肝内炎症可“溢出”至外周循环导致全身系统性炎症,这是导致ACLF发生及进展的关键因素。与此同时,外周循环的细菌DNA及其相应细菌群落结构可能发生变化,而菌群紊乱可能并进一步加重疾病进展。本课题旨在研究慢加急肝衰竭患者外周循环免疫的改变,同时研究在此状态下,外周循环的细菌16SrRNA组学如何发生变化,以进一步增加对慢加急肝衰竭的发病机制的理解,最后基于循环炎症标志物对现有评分模型进行改进,以准确预测患者的预后,为慢加急肝衰竭的临床决策提供依据。方法:1.在2017年8月至2018年5月期间,纳入50例乙型肝炎相关的ACLF(HB-ACLF)患者,23例健康对照(HC)和25例代偿期肝硬化(C-LC)患者并进行随访,收集血浆,通过流式磁珠法检测趋化因子及细胞因子,提取血浆总DNA,通过对细菌16S rRNA的V3-V4区域进行PCR扩增检测细菌DNA水平,进一步通过16S rDNA焦磷酸测序进行相关分析。2.在2017年8月至2017年10月期间,共纳入27例患者,其中9例为代偿期肝硬化患者,9例为失代偿期肝硬化患者(D-LC),9例为ACLF患者,同时纳入9例健康志愿者做为对照。收集全血并分离外周全血免疫细胞,提取细胞总RNA,使用RT2 ProfilerTM PCR芯片检测Toll样受体(TLR)信号通路的转录表达,寻找差异表达基因并绘制TLR信号通路变化图谱。3.在2017年8月至2018年3月期间,从6家医院前瞻性地招募了 151例HB-ACLF患者并进行随访。收集血浆,使用ELISA检测sCD163,中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和和肽素(copeptin)水平。分析新型生物标志物与死亡之间的关联,同时评价生物标志物联合肝衰竭临床常用评分模型如终末期肝病模型(MELD),APASL-ACLF研究联盟评分(AARC-ACLF)和慢性肝衰竭协作组ACLF评分(CLIF-C ACLF)预测患者预后的优越性。结果:1.与健康对照组及代偿期肝硬化患者相比,HB-ACLF患者的外周循环中细菌DNA载量显著增加,但总的16SrRNA分型多样性显著降低。此外,HB-ACLF患者外周循环16SrRNA对应的菌群中Moraxellaceae,Sulfurovum,Comamonas,和Burkho lderiaceae 呈 高 丰 度 而 Actinobacteria,Deinococcus-Thermus,Alphaproteobacteria,Xanthomonadaceae 和 Enterobacteriaceae 呈低丰度。网络分析显示HB-ACLF患者外周循环中Burkholderiaceae DNA的相对丰度与血浆趋化因子IP-10水平之间呈正相关。Prevotellaceae DNA的相对丰度与患者的28天死亡独立相关。功能性宏基因组学预测显示ACLF患者外周循环中细菌DNA富集与甲烷,丙氨酸,天冬氨酸,谷氨酸,嘧啶,嘌呤和能量代谢相关的基因。2.与健康对照相比,ACLF患者外周血多形核白细胞(PMN)和外周血单个核细胞(PBMC)中下调的TLR通路基因显著多于肝硬化患者。在ACLF患者的PMN 中观察到 TLR3,IFNG,IL1B,CXCL8,TBK1,PTGS2 和 LTA 等基因表达显著下调,TLR9,FADD,IRAK1,CD14,HPSA1A,IL10,ELK1 等基因表达显著上调。在其 PBMC 中,TLR3,TLR9,TLR10,SIGIRR,IFNG,CCL2,CXCL10,PTGS2,IFNB1,LTA,IL2,IL12A 和 IRAK2 等基因表达显著下调,而 IRAK1,CD14,IL10基因表达显著上调。3.共有151例HB-ACLF患者纳入该研究。晚期ACLF患者的血浆sCD163(P=0.001),NGAL(P=0.006)和 copeptin(P=0.049)水平均显著高于早期ACLF患者。在28天的随访过程中有34例患者死亡(22.5%)。sCD163和NGAL显示出与28天死亡率有较强的独立相关性。通过受试者工作特征曲线下面积(AUROC),Akaike信息准则(AIC),综合判别改善指数(IDI)和净重新分类改善指标(NRI)评估后发现,将sCD163和NGAL纳入到传统的评分系统中能更好的预测患者的短期预后。结论:1.HB-ACLF患者外周循环中的细菌DNA载量增加,细菌16SrRNA分型多样性减少,提示菌群构成及潜在功能发生了显著改变。循环中细菌DNA构成变化与HB-ACLF患者的系统性炎症和临床结局密切相关。2.ACLF患者外周循环的PBMC和中性粒细胞的TLR通路基因表达谱呈现出免疫抑制特征。3.sCD163和NGAL是HB-ACLF患者短期死亡的独立预测因素。联合使用sCD163和NGAL能更好的评估患者的短期预后。