论文部分内容阅读
目的:建立顺铂诱导的小鼠急性肾损伤模型,研究苦参碱对顺铂诱导的小鼠急性肾损伤模型的保护作用。通过对凋亡、自噬相关指标进行检测,进一步探讨凋亡、自噬与苦参碱改善顺铂诱导的小鼠急性肾损伤机制之间的关系。并运用生物信息学进行通路预测,为下一步实验提供理论基础。方法:1.观察不同浓度顺铂对肾脏的影响。将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为以下5组:（1）正常组;（2）顺铂10 mg/kg组;（3）顺铂20 mg/kg组;（4）顺铂30 mg/kg组;（5）顺铂40 mg/kg组。注射顺铂后,第3 d处死小鼠,检测小鼠血清肌酐和尿素氮,肾组织行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin,HE）观察肾脏病理变化情况,观察不同浓度顺铂对小鼠肾脏的影响,探索本研究所需的顺铂最佳注射浓度。2.观察苦参碱对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠的影响。将18只雄性C57BL/6小鼠随机分为以下3组:（1）正常对照组;（2）顺铂组;（3）苦参碱+顺铂组。在给药后第3 d处死小鼠,通过检测血清肌酐和尿素氮以评估肾功能,组织HE染色检测肾脏病理形态学变化情况,缺口末端标记技术（Td-mediated dudpo-x nick end Labeling,Tunel）检测小鼠肾脏凋亡情况,实时荧光定量（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技术检测小鼠肾脏的凋亡变化、自噬情况,应用免疫组化技术检测小鼠肾脏凋亡、自噬相关蛋白表达改变,免疫蛋白印迹（Western blotting,WB）技术检测小鼠肾脏的凋亡及自噬相关蛋白表达。3.苦参碱治疗急性肾损伤的生物信息学分析。运用Swiss Target Prediction预测苦参碱的潜在靶标,从Gene Cards数据库下载急性肾损伤的靶点信息。将得到的苦参碱潜在靶点信息和急性肾损伤靶点信息通过Draw Venn Diagram取交集,即可获得苦参碱治疗急性肾损伤的靶点基因信息。将苦参碱治疗苦参碱的靶点基因信息输入Profiler分别进行基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。结果:1.血清肌酐和尿素氮,肾组织HE染色结果表明:与正常对照组相比,随着顺铂注射浓度增加,小鼠肾小管损伤加重,肾小管上皮细胞肿胀、坏死加重,小管管型明显增多,肾功能损伤加重,浓度为30 mg/kg最显著（P＜0.05）。2.与顺铂组相比,苦参碱+顺铂组,血清肌酐和尿素氮明显降低（P＜0.05）;肾脏组织HE染色显示,与顺铂组相比,苦参碱+顺铂组小管细胞损伤明显减轻（P＜0.05）;免疫荧光Tunel检测结果显示,与顺铂组相比,苦参碱+顺铂组肾脏凋亡阳性细胞减少;RT-PCR结果显示与顺铂组相比,苦参碱+顺铂组促凋亡指标B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma protein-2,Bcl-2）相关的X蛋白（BCL-2 associated X,Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cysteine aspartic acid proteinase 3,Caspase3）的m RNA表达明显降低,抗凋亡指标Bcl-2的表达明显升高,自噬指标微管相关蛋白1轻链3（Microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3）m RNA的表达明显增高;免疫组化结果显示,与顺铂组相比,苦参碱+顺铂组促凋亡指标Bax,Caspase3的蛋白表达降低,抗凋亡指标Bcl-2的蛋白表达升高,自噬指标LC3蛋白表达增高;WB结果显示,与顺铂组比较,苦参碱+顺铂组促凋亡指标Bax的表达降低（P＜0.05）,抗凋亡指标Bcl-2的表达升高（P＜0.05）,自噬指标LC3增高（P＜0.05）。3.从Swiss Target Prediction中鉴定了98个相应的苦参碱潜在靶标。筛选设定P＜0.05,根据P值共筛选出48个苦参碱潜在靶标。从Gene Cards数据共获得7040个急性肾损伤相关靶点。通过Draw Venn Diagram取交集之后,共获得35个靶点基因。将35个靶点基因导入到Profiler,分析发现,苦参碱治疗急性肾损伤的生物过程与分子功能主要涉及钙离子或者神经递质介导的信号转导通路等。苦参碱治疗急性肾损伤的通路主要有神经活性配体-受体相互作用、环磷酸腺苷信号通路、钙信号通路、辅助型T细胞（Th）1/Th2细胞分化。结论:1.在顺铂引起的急性肾损伤小鼠模型中,苦参碱预处理对小鼠的肾脏有明显的保护作用,其保护作用可能是通过抑制肾小管上皮细胞发生凋亡和增强自噬而实现。2.苦参碱可能通过通过影响c AMP信号通路和Ca2+信号通路调控自噬和凋亡从而起到保护急性肾损伤肾脏的作用,需要进一步实验验证。