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肿瘤是目前导致人类死亡的第二大病因,仅排在心血管疾病之后,是严重危害人类健康的重大疾病。肿瘤的形式多种多样,可发生于机体任何组织器官,而消化系统是肿瘤的高发部位,在前十大恶性肿瘤中,消化系统肿瘤就占5种。胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一,在肿瘤中的全球发病率排第五位,死亡率则排第三位,我国的发病率和死亡率均排第2位,严重危害人类健康。胃癌一直都是肿瘤领域研究的重点和热点,其发生发展机制复杂,许多分子和信号通路均参与了胃癌的发生发展。但到目前为止,我们对胃癌发生的确切机制了解仍相对不足,胃癌的临床治疗效果特别是进展期胃癌仍较差,总体5年生存率不超过25%。因此,加强对胃癌发生发展分子机制的研究对于胃癌的临床诊治具有重大意义。信号转导通路包括经典的Wnt/β-catenin、AKT等,在胃癌的发生发展中发挥着重要作用,参与调控胃癌细胞恶性增殖、侵袭转移、化疗抵抗以及肿瘤微环境等诸多方面,因而研究信号转导通路对于丰富胃癌发生发展的分子机制有重大的理论意义和临床价值。Norrin是可以激活经典的Wnt/β-catenin信号通路的非经典配体,先天性x连锁智力迟钝盲聋病,亦称Norrie病(Norrie disease),由其致病基因NDP(Norrie disease pseudoglioma gene)编码。Norrin作为一种以旁分泌或自分泌起作用的分泌型蛋白,其C端富含半胱氨酸,故属于TGF-β家族成员,但其特殊性是可以通过与Frizzled-4、Lrp5及Lrp6结合进而激活Wnt/β-catenin信号通路,参与调控机体众多生物学功能,对于维持视网膜、内耳以及脑的正常功能都发挥着重要作用。近年来,发现Norrin在肿瘤的发生发展也起着重要作用。有文献报道,在结肠癌细胞株以及结肠癌组织中发现了Norrin及其下游结合分子Frizzled-4、Lrp5等的表达,其可能通过促进血管生成进而参与结肠癌的发生发展;另外有文献报道,Norrin可能在卵巢癌中起抑制作用,并与卵巢癌患者预后相关。目前国内外的研究结果显示Norrin在肿瘤中可能存在促癌与抑癌的双重作用,提示Norrin在肿瘤的作用可能具有组织特异性。目前关于Norrin与胃癌的研究极少,Norrin在胃癌组织中是否能激活经典的Wnt/β-catenin信号通路尚不明确,在胃癌组织中Norrin与其他信号通路的关系则更不清楚。因此,明确Norrin是否影响信号转导通路,以及Norrin在胃癌发生发展进程中是否具有一定作用,对于进一步阐明胃癌发生发展的分子机制和提高胃癌临床诊治效果具有一定的理论意义和临床价值。研究方法与研究结果1)Western blot检测Norrin在正常胃黏膜上皮细胞GES-1和不同分化程度的人胃腺癌细胞株SGC7901、AGS、MGC823和XN0422中的表达情况,发现Norrin在各种分化程度的人胃腺癌细胞株中含量均明显高于正常胃黏膜上皮细胞GES-1。2)通过免疫组织化学染色,统计分析临床病理资料,我们发现Norrin在胃癌组织中表达高于癌旁组织;Norrin蛋白的表达高低与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、病理学分级无统计学差异,(P>0.05);而Norrin蛋白的表达高低与胃癌患者的T分期、N分期、TNM分期和术后生存率有统计学差异,(P<0.05)。另外,分析TCGA和KM-Plotter公共数据库,发现Norrin mRNA的表达高低与胃癌患者的术后生存率具有统计学差异,(P<0.05)。进一步分析KM-Plotter公共数据库,发现胃癌患者Norrin mRNA表达水平与earlier first progression(FP)和post progression survival(PPS)有统计学差异,(P<0.05)。3)采用慢病毒转染的方法成功构建Norrin低表达人胃癌细胞株XN0422(Sh-Norrin组),和转染了空载病毒、Norrin正常表达的XN0422细胞株(Sh-Ctrl组)。4)采用Western blot检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的Frizzled-4、Lrp5以及Lrp6的含量,结果显示Norrin并不影响其下游结合分子Frizzled-4、Lrp5及Lrp6的表达水平。5)采用Western blot,检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的β-catenin、磷酸化的β-catenin及部分Wnt/β-catenin下游靶基因CD44、MMP7,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组β-catenin表达水平不变、磷酸化的β-catenin增多、CD44和MMP7减少。分析TCGA数据库,显示较多Wnt/β-catenin下游靶基因如Lgr5、CDX1、ASCL2以及SOX9的表达水平与Norrin无明显相关性。6)采用Western blot,检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的AKT、Hippo、JNK、P38和ERK1/2信号通路活性,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组p-AKT明显降低,总AKT不变;Hippo、JNK、P38和ERK1/2活性无明显改变。7)采用Western blot,检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的m-TOR、磷酸化的m-TOR、Bim以及P27kip1的表达水平,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组m-TOR不变、p-m-TOR减少、Bim以及P27kip1增加。分析TCGA数据库显示,P27kip1的表达水平与Norrin呈负相关(P<0.05);而Rictor的表达水平与Norrin呈正相关(P<0.01)。8)加入小分子AKT激活剂SC79恢复AKT活性,采取CCK8、平板克隆及流式细胞学检测细胞周期等方法检测XN0422细胞增殖能力,我们发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组CCK8 OD值降低、平板克隆数减少、S期细胞减少而G0/G1细胞增多(P<0.05);而恢复AKT活性后,Sh-Norrin-SC79组较Sh-Norrin-DMSO组CCK8 OD值升高、平板克隆数增加、S期细胞增多而G0/G1细胞减少,(P<0.05)。9)加入小分子AKT激活剂SC79恢复AKT活性,采用划痕实验和Transwell实验,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组迁移的距离减短、Migration和Invation的细胞数目减少,(P<0.05);而恢复AKT活性后,Sh-Norrin-SC79组较Sh-Norrin-DMSO组迁移的距离增加、Migration和Invation的细胞数目增多,(P<0.05)。10)Western blot检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的EMT标志物变化,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组E-cadherin及Slug无明显变化,N-cadherin、Vimentin、Claudin-1、Snail、Zeb1均降低。结论1)Norrin蛋白在人胃癌细胞株SGC7901、AGS、MGC823和XN0422中表达含量均高于正常胃黏膜上皮细胞GES-1。免疫组化结果表明胃癌组织和癌旁组织中Norrin的表达含量有显著差异,结合临床病理资料分析表明,Norrin与胃癌患者的T分期、N分期、TNM分期以及预后密切相关。数据库结果显示Norrin的表达含量与胃癌患者预后相关。这提示Norrin很可能是促癌分子,在胃癌的发生发展过程起到一定的促进作用。2)在人胃癌细胞株XN0422中敲低Norrin可导致AKT信号通路活性明显下降,而β-catenin表达不变、P-β-catenin表达增加、部分Wnt/β-catenin下游靶基因CD44、MMP7表达降低,说明不能完全排除Norrin对Wnt/β-catenin的作用,Norrin可能部分通过AKT信号通路发挥其生物学功能。3)干扰Norrin的表达后,XN0422细胞的增殖及侵袭迁移能力降低,而加入Norrin小分子AKT激活剂SC79可在一定层度上恢复增殖及侵袭迁移能力,说明Norrin可部分通过AKT信号通路调控胃癌细胞的增殖及侵袭迁移,从而参与胃癌的发生发展。