【摘 要】
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嗜酸乳杆菌是一种能够定植于人体肠道中的益生菌,其定植能力的实现主要靠自身S-层蛋白对肠上皮细胞的粘附。AI-2/LuxS群体感应系统是细菌之间通过信号分子交流的一种方式,广泛存在于多种细菌中。大量的研究表明,LuxS介导的群体感应系统在生物膜的形成过程中起着十分重要的作用,但AI-2/LuxS群体感应系统对嗜酸乳杆菌CICC6074介导作用的研究尚未报道。本文拟从AI-2/LuxS群体感应系统对嗜
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嗜酸乳杆菌是一种能够定植于人体肠道中的益生菌,其定植能力的实现主要靠自身S-层蛋白对肠上皮细胞的粘附。AI-2/LuxS群体感应系统是细菌之间通过信号分子交流的一种方式,广泛存在于多种细菌中。大量的研究表明,LuxS介导的群体感应系统在生物膜的形成过程中起着十分重要的作用,但AI-2/LuxS群体感应系统对嗜酸乳杆菌CICC6074介导作用的研究尚未报道。本文拟从AI-2/LuxS群体感应系统对嗜酸乳杆菌CICC6074 S-层蛋白表达情况的影响展开研究。本课题的主要研究结果如下:1、采用分子克隆技术检验嗜酸乳杆菌CICC6074是否具有luxS基因并用分子生物学的方法检测其是否产生群体感应信号分子AI-2。通过基因测序并与嗜酸乳杆菌NCFM比对;使用多功能酶标仪的化学发光模式检测嗜酸乳杆菌CICC6074是否产生AI-2信号分子。比对结果发现嗜酸乳杆菌CICC6074与嗜酸乳杆菌NCFM的相似度为1 00%;嗜酸乳杆菌CICC6074能够产生具有活性的AI-2信号分子,随着菌体的生长AI-2分子的活性也随之增加,在对数中期达到最大值。证明了嗜酸乳杆菌CICC6074具有催化AI-2信号分子合成的luxS基因,并且能够产生具有活力的AI-2信号分子。2、采用PCR扩增slpA基因部分片段,将slp4基因片段导入大肠杆菌进行体外表达,细胞破碎后获得SlpA蛋白,用蛋白纯化试剂盒对该蛋白进行纯化,将纯化后的蛋白注入新西兰兔体内进行免疫反应,初次免疫前采集兔的血清作为阴性对照,多次免疫后耳缘静脉采血检验抗体校价,采用酶联免疫吸附法测定抗体效价,达标后采集兔的血液并将血清分离出来,获得的抗血清采用抗原亲和纯化,采用间接酶联免疫吸附法测定纯化后的抗体的效价。结果表明空白和阴性对照OD<0.2,亲和层析纯化后OD1:64K>1.0,ELISA titer>1:64K,所得结果满足要求。3、通过设计特异性引物,扩增luxS基因片段,克隆至pHL460载体上,获得重组表达载体pUS460,导入嗜酸乳杆菌CICC6074中,加入SppIP诱导表达,细胞破碎法提取LuxS蛋白,LiCl提取S-层蛋白,采用qPCR检验luxS基因表达情况,WB检测LuxS蛋白、S-层蛋白表达量。成功构建luxS基因表达载体pUS460,且该基因能够在嗜酸乳杆菌CICC6074中表达。LuxS蛋白表达量的上升引起了嗜酸乳杆菌CICC6074 S-层蛋白表达量的上调。证明AI-2/LuxS群体感应系统能够介导嗜酸乳杆菌CICC6074 S-层蛋白的表达。综上所述,本文检测到嗜酸乳杆菌CICC6074能够产生AI-2信号分子,采用qPCR以及Westernblot检测luxS基因对S-层蛋白表达量的影响,为AI-2/LuxS群体感应系统介导嗜酸乳杆菌CICC6074的益生特性的进一步研究奠定了基础。
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