【摘 要】
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木质纤维素资源是地球上最丰富、最廉价的可再生资源,但因纤维素结构复杂,在生物转化中很难被微生物直接利用,导致不能满足工业化生产的需求。本课题组在前期研究中,从生孢噬纤维菌（Sporocytophaga）CX11中筛选并异源表达了一个内切纤维素酶,纯化后获得重组蛋白SmCel5A,该蛋白同时具有内切酶和外切酶的活性,是一个持续性内切纤维素酶。为继续挖掘SmCel5A的应用潜力,本论文主要围绕SmCe
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木质纤维素资源是地球上最丰富、最廉价的可再生资源,但因纤维素结构复杂,在生物转化中很难被微生物直接利用,导致不能满足工业化生产的需求。本课题组在前期研究中,从生孢噬纤维菌（Sporocytophaga）CX11中筛选并异源表达了一个内切纤维素酶,纯化后获得重组蛋白SmCel5A,该蛋白同时具有内切酶和外切酶的活性,是一个持续性内切纤维素酶。为继续挖掘SmCel5A的应用潜力,本论文主要围绕SmCel5A的酶学性质表征和SmCel5A与β-葡萄糖苷酶的协同作用展开研究。论文首先对重组蛋白SmCel5A的酶学性质进行了表征:SmCel5A对羧甲基纤维素钠（CMC）的比酶活高达281.74±15.32 U/mg,对多种植物多糖也有一定的水解能力;根据SmCel5A的酶促反应动力学参数,SmCel5A对CMC的Km值最小,对Avicel的Km值最大,证明其对可溶性、结晶度低的底物亲和力相对较大;SmCel5A对CMC和Avicel的kcat/Km值比其他持续性内切纤维素酶高,说明SmCel5A有较高的催化活性;SmCel5A的最小作用底物为纤维三糖但没有转糖基功能;SmCel5A水解滤纸的产物以纤维二糖和纤维三糖为主,表现出一定的持续降解能力。其次,论文对SmCel5A与β-葡萄糖苷酶的协同作用进行了探究。SmCel5A与来源于杏仁的商品化β-葡萄糖苷酶进行协同反应,SmCel5A与β-葡萄糖苷酶以1:3的质量比反应3 h时,协同效果最好,Do S值为1.81,超过12 h的协同反应,质量比为1:1的协同效果最好,随着反应时间的延长,协同反应的底物转化率和还原糖产量持续增长,并在反应48 h时达到最高底物转化率73.2%。另发现达到最大转化率所需要的β-葡萄糖苷酶的量随反应时间的延长逐渐减少,说明在协同反应中SmCel5A起主导作用,且在提高底物转化率的同时减少了生物质降解中酶的使用成本。以较天然纤维素生物质为底物,使用来自于杏仁的商品化β-葡萄糖苷酶和Sm＿4302与SmCel5A进行协同。降解玉米芯粉时,SmCel5A与商品β-葡萄糖苷酶的组合更好;而降解玉米秸秆,SmCel5A与Sm＿4302的组合更好。SmCel5A和两个β-葡萄糖苷酶协同降解天然的纤维素生物质的底物转化率都很低,后续可以通过增强酶与底物的亲和力、改善纤维素酶的酸碱耐受性等方法提高底物转化率。
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