肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一,中国肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。在我国,乙型肝炎病毒(HBV)感染是首要原因,并且超过80%肝癌病例是由慢性乙肝感染(慢乙肝)所导致。目前我们对乙肝病毒的致病机制还不完全清楚,慢乙肝以及慢乙肝所致肝癌仍是我国面临的公共卫生挑战。一方面,HBV病毒特异性感染肝细胞,在肝细胞中完成病毒自身复制等生命过程。HBV病毒的共价闭合环状双链DNA(covalent closed circle DNA,ccc DNA)在宿主细胞中会与组蛋白缠绕,形成微小染色质。ccc DNA微小染色质是HBV病毒自身转录复制的模板,但是目前抗HBV药物:核苷类似物(nucleoside analogue,NA)和α-干扰素(interferon-alpha,IFN-α)难以清除或有效抑制ccc DNA微小染色质的转录。目前我们对介导ccc DNA微小染色质的形成、维持和表观调控的分子机制了解有限,对HBV ccc DNA微小染色质表观调控机制的更深入研究十分必要和紧迫。另一方面,HBV病毒基因组也会整合进入宿主肝细胞基因组,会通过各种机制诱导肝细胞转录调控和表观遗传学调控紊乱,从而促进肝癌的发生发展。表观遗传学调控紊乱在肿瘤中广泛存在、并且发挥重要功能。但是,目前我们对乙肝所致肝癌的表观遗传学研究还不够透彻。表观遗传学是指在不改变DNA序列的前提下,基因的表达发生可遗传的调控机制。主要包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰、核小体定位、染色质的空间构象等内容。其核心功能就是控制DNA遗传密码根据外界信号指令进行时空有序的开放表达与关闭沉默。在诸多表观遗传调控机制中,核小体组蛋白的翻译后修饰以其重要性和多样性引起国内外学者的广泛研究。其中,组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)是基因活化表达的关键标志,主要富集在基因的启动子以及增强子上。既往检测H3K4me3修饰的主要方法为染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术,但是该技术要求起始细胞量较大,对于一些临床珍稀标本,如肝穿刺标本,此检测难以开展。用于检测低细胞起始量的表观新技术亟待开发。我们既往的研究发现HBV可以在全基因组水平上调宿主细胞H3K4me3修饰,从而促进了相应基因的表达开放。也有类似研究发现,HBV ccc DNA微小染色质也富集了H3K4me3修饰,对HBV病毒自身的转录复制至关重要。这些研究提示H3K4me3表观修饰可能在乙肝病毒的生命过程及其致病过程中发挥重要作用,但是具体机制有待深入研究。WDR5是催化H3K4me3的表观修饰酶复合体中的关键蛋白,其在多种肿瘤中报道高表达,发挥促癌基因作用。但是在慢乙肝所致肝癌中的表达情况不清。有鉴于此,本文的第一部分探讨了HBV上调H3K4me3修饰的详细分子机制,阐述了H3K4me3修饰对宿主细胞肿瘤发生以及HBV自身复制转录的重要性,找到了潜在的治疗靶点和临床应用。而本文的第二部分则着重从方法学角度出发,构建了从低细胞起始量的样本中检测组蛋白修饰的染色质免疫切割测序(sc Ch IC-seq)技术以及检测单细胞核小体定位以及染色质可接近性的scMNase-seq技术。研究内容和主要结果如下:第一部分HBx上调WDR5对乙肝和肝癌的调控作用和机制研究一、慢乙肝所致HCC中WDR5的表达升高1.HBV感染的肝癌组织中WDR5蛋白表达水平显著高于癌旁和正常组织;2.WDR5在95例HBV阳性的肝癌患者中高表达与术后生存时间呈负相关;3.WDR5在95例HBV阳性的肝癌患者中表达水平与HBx表达水平呈正相关。二、WDR5可促进HCC增殖和转移1.体外实验证实WDR5促进肝癌细胞增殖能力;2.体外实验证实WDR5促进肝癌细胞转移能力;3.裸鼠实验证实WDR5促进肝癌细胞体内成瘤能力。三、WDR5可促进HBV ccc DNA的转录1.WDR5可促进ccc DNA转录;2.WDR5可促进乙肝复制。四、HBV通过泛素化修饰上调WDR5蛋白1.HBV可上调WDR5蛋白水平而不是其m RNA水平;2.HBV可延长WDR5蛋白半衰期;3.HBV可抑制WDR5蛋白泛素化修饰。五、HBx在WDR5蛋白泛素化调控中发挥作用1.HBx可以延长WDR5蛋白半衰期;2.HBx直接调控WDR5蛋白泛素化修饰;3.HBx可体内体外上调WDR5蛋白水平。六、HBx竞争性结合泛素酶DDB1,拮抗了DDB1对WDR5的泛素化降解1.DDB1是WDR5蛋白泛素化修饰的催化酶;2.HBx与DDB1的结合对稳定WDR5蛋白至关重要;3.HBx与DDB1的结合上调WDR5蛋白水平;4.HBx与DDB1的结合可以抑制DDB1对WDR5蛋白的泛素化调控;5.HBx与DDB1竞争性结合。七、HBx通过WDR5促进H3K4me3修饰1.HBV可促进全基因组H3K4me3修饰;2.WDR5可促进全基因组H3K4me3修饰;3.HBx、WDR5可促进靶基因启动子区H3K4me3修饰;4.WDR5可促进ccc DNA的H3K4me3修饰。八、HBx招募WDR5促进H3K4me3修饰3.HBx与WDR5在靶基因共定位;2.HBx与WDR5、H3K4me3在全基因组共定位;3.HBx/WDR5共结合靶基因富集在相关的促癌基因以及肿瘤信号通路上;4.HBx与WDR5蛋白直接结合;5.HBx通过“α-helix”结构域与WDR5直接结合;6.“α-helix”结构域对HBx结合染色质发挥作用;7.“α-helix”结构域对HBx促癌发挥作用。九、WDR5抑制剂可对肝癌和乙肝有治疗作用1.WDR5小分子抑制剂(WDR5-0103)可以在体内和体外实验中抑制肝癌细胞增殖和转移能力;2.WDR5-0103可抑制ccc DNA的转录。第二部分组蛋白修饰和核小体定位的新方法研究一、单细胞染色质免疫切割测序(sc Ch IC-seq)新方法1.sc Ch IC-seq技术可检测低细胞起始量和单细胞的组蛋白修饰;2.sc Ch IC-seq技术可检测到单细胞组蛋白修饰的表观异质性。二、单细胞MNase测序技术(scMNase-seq)新方法1.scMNase-seq技术检测单个细胞的核小体定位和染色质可接近性;2.scMNase-seq技术可检测细胞间核小体定位异质性;3.scMNase-seq技术发现核小体排列规律;4.scMNase-seq技术发现同一个DHS区域核小体排列存在异质性;5.scMNase-seq技术可预测细胞分化方向。综上所述,本研究的主要结论和意义是:1.HBV病毒通过其编码的HBx蛋白上调宿主细胞组蛋白甲基转移酶核心亚基WDR5蛋白水平,进而调控宿主以及自身ccc DNA基因组的表观遗传学H3K4me3修饰。一方面,异常上调的H3K4me3修饰导致了宿主染色质表观调控紊乱,使癌基因大量激活表达;另一方面,HBV通过H3K4me3维持了自身ccc DNA染色质开放状态,促进了病毒自身的转录复制。2.HBx通过WDR5蛋白上调H3K4me3修饰的分子机制:一方面,HBx劫持宿主泛素化酶DDB1,通过与DDB1的竞争性结合,拮抗了DDB1对WDR5的泛素化修饰,进而使WDR5免于被降解;另一方面,HBx通过其“α-helix”结构域与WDR5直接结合,募集WDR5到相应染色质,促进H3K4me3修饰。3.构建了从低细胞起始量的样本中检测组蛋白修饰的染色质免疫切割(sc Ch ICseq)技术和检测单细胞水平核小体定位的scMNase-seq技术,发现了细胞间存在显著的核小体定位和组蛋白修饰的表观异质性,找到了核小体在染色质开放和沉默区域不同的排布规律。本研究报道了WDR5蛋白在慢乙肝所致肝癌中高表达,并且与临床预后相关。解析了WDR5蛋白在慢乙肝所致肝癌中的上调分子机制,以及对下游表观修饰H3K4me3的影响。提出了HBx-WDR5-H3K4me3作用通路在慢乙肝及其所致肝癌中的重要作用。并且,构建了从低细胞起始量的样本中检测表观遗传学信息的sc Ch IC-seq和scMNaseseq技术,为慢乙肝防治补充了新的分子机制,引入了潜在靶标,提供了可行新技术。