研究背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染呈世界性流行,据报道,全球有20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿为慢性感染者。而我国的慢性HBV感染者有9300万,其中慢性乙型肝炎患者有2000万。HBV感染可以引起,从无症状携带到急性肝炎(acute hepatitis B, AHB)、慢性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、肝硬化、肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)以及肝衰竭等一系列疾病谱。其中,慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF):在慢性肝病基础上出现病情的急性加重,临床表现多样并且死亡率高,根据亚太肝病学会最新的定义,ACLF是指“在之前已诊断或尚未诊断的慢性肝病基础上,出现黄疸和凝血功能障碍的急性肝脏损害,并且在发病4周内并发腹水和/或肝性脑病”。在我国,90%以上的ACLF病例存在HBV感染,称之为乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(Hepatitis B related acute-on-chronic liver failure, HB-ACLF)。相对于庞大的HBV感染人群,HB-ACLF的发生率虽然相对较低,但患者病情重,治疗费用高,预后不良,死亡率高达50-90%,肝移植是唯一有效的临床治疗手段,但目前供体来源异常缺乏,一般患者常常难以实现。HB-ACLF的发生机理目前仍不明确。一般认为,病毒和宿主两方面的因素都参与了HB-ACLF的发生。来自日本的几项研究发现,HBV Bj (B1)基因亚型与暴发性肝炎(Fulminant hepatitis, FH)的发生相关。另外,多项研究显示,前C基因区(PC)和C基因启动子区(BCP)的变异与FH的发生相关。体外研究结果显示,这些病毒变异可能通过增强HBV的复制能力和／或下调HBeAg的表达而引起肝炎急性加重或重症化；然而,来自亚洲以及欧洲的几项小样本量调查研究未发现HBV BCP/PC变异与FH的发生相关。在中国,ACLF发生率较FH高,其临床症状也不同于FH,后者在AHB的基础上发生。近年来,国内不同地区的几个研究小组对HBV基因型及基因变异与ACLF间的关系进行了探索,结果不尽相同。来自北京302医院的Ren等发现,与其他CHB患者相比,基因型B、T1753V (C/A/G)、A1762T、G1764A, G1896A和G1899A位点变异在ACLF患者中更为多见。我们之前的研究发现,与其他CHB患者相比,基因型B在ACLF患者中更为多见；在基因型B中,A1762T/G1764A, A1846T及G1896A位点变异率高于其他CHB患者。在病毒基因变异发生率方面,类似结果在其他的研究中也有报道,但未发现基因型B与ACLF目关。另外,Yan等从纵向和横向两个方面对二者的关系进行探索,发现在纵向研究中,A1846T和G1896A位点变异与ACLF相关；在横向研究中,A1846T和C1913A/G位点变异与ACLF相关,但均未发现基因型B与ACLF相关。因此,HBV基因型B是否与HB-ACLF的发生相关,哪些常见的位点变异与lHB-ACLF的发生相关,目前存在争议。考虑到这些研究均为单个中心研究,HBV的基因型分布存在地域差异,在中国的北方地区,以基因型C为主；而在中国的南方地区基因型B更为多见,而不同的基因型中位点变异率的发生情况也存在差异,因此,需要一个多中心的研究来阐明HBV基因型及基因变异与ACLF间的关系。另外,这些因素是如何来发挥作用诱导疾病的产生的,目前也不十分清楚。体外研究显示前C/C基因启动子区的变异可增强HBV复制活性,或/和影响HBeAg水平的表达,因此推测这些变异或许通过这两种途径在肝衰竭的发生中发挥重要作用。但是也有研究发现,C/C基因启动子区的变异对HBV复制活性无明显影响。因此,关于前C/C基因启动子区的变异对病毒生物学特征的影响也存在争议,需要进一步的验证。本研究通过对HB-ACLF、重度和轻度慢性乙型肝炎患者(CHB-S和CHB-M)的血清中病毒学特征进行比较分析,阐明HBV基因型及哪些基因变异与慢加急性肝衰竭的发生有关,并以此为基础,构建相应的不同基因型、含有不同变异模式的重组质粒转染Huh7细胞进行体外研究,对这些因素可能的致病机理进行初步探讨。第一章乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭患者的血清中病毒学特征分析目的：比较分析来自多中心HB-ACLF、重度和轻度慢性乙型肝炎患者(CHB-S和CHB-M)的血清中病毒学特征,阐明HBV基因型及哪些基因变异与HB-ACLF的发生有关。方法：自2011年1月至2012年6月,本研究共收集来自中国的南部、东部、西部和中部4个中心的522例患者的血清标本,广东省215例、浙江省147例、四川省100例、湖北省60例；其中包括CHB-M患者231例、CHB-S患者84例、HB-ACLF207例。所有纳入的患者,其血清HBsAg日性的持续时间均大于6个月。HB-ACLF患者的纳入标准为：(1)血清总胆红素(TBIL)>171.1μmol/L;(2)凝血酶原活动度(PTA)<40%；和(3)在慢性肝病的基础上急性起病,并且在4周内出现腹水和/或肝性脑病。CHB-S患者的纳入标准为：(1)血清TBIL>85.5μmol/L;或(2)PTA>40%,但≤60%；或(3)血清白蛋白(ALB)<32g/L；不足以诊断为HB-ACLF。CHB-M患者的纳入标准为：(1)血清谷丙转氨酶(ALT)>80U/L;和(2)血清TBIL<85.5μmol/L.所有患者均排除以下情况：(1)合并有丙、丁、戊型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒的感染；或(2)合并恶性肿瘤；或(3)自身免疫性疾病。血清标志物检测采用化学发光免疫分析仪进行,HBV DNA水平通过罗氏实时荧光定量PCR系统进行检测,检测范围为1×103-1×109copies/ml。肝功能检测包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)等。提取血清中的HBV DNA并进行PCR扩增,采用巢式PCR法分别扩增S基因和BCP/PC/C区序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,再用ABI3730测序仪进行序列测定。用MEGA5软件对获得的测序结果进行排列,并与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中的A-G7种HBV基因型参考序列进行比对,S基因区序列用于基因分型,BCP/PC/C区序列用于分析不同变异位点发生频率以及与基因型的相关性。数据的统计学处理采用SPSS16.0软件,患者资料中,计量资料采用One-way ANOVA或Kruskal-Wallis H检验进行分析；计数资料构成比采用卡方检验(Pearson chi-square检验或Fisher’s Exact检验),多因素分析采用二分类logistic逐步回归分析法。双侧P值<0.05为统计学差异有显著性。结果：1)三组患者的临床特点。性别在CHB-M、CHB-S和HB-ACLF三组患者中的差异无显著性(P=0.200)。年龄(F=28.869,P<0.001)在三组患者中的差异有统计学意义,且以慢加急性肝衰竭患者最为年长。ALT (χ2=35.272, P<0.0011)、 AST (χ2=114.053, P<0.001)及TBIL (χ2=374.139, P<0.001)水平在CHB-M、 CHB-S和HB-ACLF三组患者中依次逐渐升高,差异有统计学意义。而ALB(χ2=240.366,P<0.001)水平以及HBV DNA (F=22.808, P<0.001)和HBeAg阳性率(χ2=10.752,P=0.005)在CHB-M、CHB-S和HB-ACLF患者中依次逐渐降低,差异有统计学意义。2)三组患者的基因型分布。基因型B在CHB-M, CHB-S和HB-ACLF三组患者中所占的比例分别为49.8%(115/231),52.4%(44/84)和79.2%(164/207),依次逐渐升高；基因型C所占的比例分别为50.2%(116/231),47.6%(40/84),20.8%(43/207),依次逐渐降低；基因型分布在三组患者间的差异有统计学意义(χ2=43.948,P<0.001)。3)各省的患者基因型分布。在四川和湖北省,以B基因型为主；浙江省患者基因型C更为多见；在广东省,B和C基因型感染者的比例相当。在四川和湖北省中,HB-ACLF患者感染B基因型的比例高于CHB患者(84.1%vs73%和90.3%vs82.8%),但是差异无显著性(P=0.178和P=0.465)；在广东和浙江省中,HB-ACLF患者感染B基因型的比例显著高于CHB患者(84.6%vs60.6%和48.6%vs22.3%),差异有统计学意义(分别为χ2=13.492,P<0.001；χ2=9.004,P<0.001)。4) HBV BCP/PC/C区变异发生率在患者组间的比较。A1762T/G1764A、 A1846TG1896A、C1913A/G和A2159G六个位点变异发生率在三组患者间的差异均有统计学意义,且A1762T/G1764A (x2=10.268, P=0.006)、A1846T(χ2=29.422,P<0.001)和G1896A(χ2=31.317,P<0.001)变异在CHB-M, CHB-S和HB-ACLF三组患者中的发生率依次逐渐升高。其余五个位点T1753V、C1766T、T1768A、G1862T和G1899A变异的发生率均较低,且在三组患者间无显著性差异(P>0.05)。5) HBV BCP/PC/C区变异发生率在B和C两种基因型间不同,A1846T(χ2=22.812, P<0.001)、G1896A(χ2=47.359,P<0.001)和C1913A/G(χ2=21.506,P<0.001)变异在B基因型的发生率显著高于C基因型；而T1753V(χ2=18.596,P<0.001)、A1762T/G1764A(χ2=30.980, P<0.001)和C1766T(χ2=9.992,P=0.002)变异在C基因型中的发生率显著高于B基因型。T1768A、G1862T、G1899A和A2159G位点变异率在两种基因型间差异无统计学意义(P>0.05)。6) HBV BCP/PC/C区变异发生率根据基因型分组后,在患者组间的比较。在基因型B中,A1762T/G1764A (χ2=20.078, P<0.001)、A1846T (χ2=14.502,P=0.010)和G1896A (χ2=9.286,P=0.010)变异率在三组患者间差异有统计学意义,且A1762T/G1764A和G1896A变异在HB-ACLF患者中最多见。在基因型C中,除上述四个位点变异外,C1913A/G (χ2=10.610, P＝0.005)和A2159G(χ2=6.426,P=0.040)变异率在三组患者间的差异也有统计学意义,且所有位点变异在HB-ACLF患者中最多见。7) HBV BCP/PC/C区变异率较高的六个变异在不同年龄组的发生率。整体上看,A1762T/G1764A, A1846T和G1896A位点的变异率在CHB患者中随着年龄的增长而逐渐增加,但这种上升趋势在HB-ACLF患者中不明显,另外这四个位点在绝大多数年龄组中,其在HB-ACLF患者的变异率高于CHB患者,尤其是在年龄小于30岁的患者中。HB-ACLF患者中C1913A/G和A2159G变异,在绝大多数年龄组的发生率均高于CHB患者,并且这两个变异的发生率并未随着年龄的增长而升高。且仅在基因型B中,A1762T/G1764A (x2=13.569,P=0.004)、A1846T (x2=14.139, P=0.003)和G1896A (x2=8.434,P=0.038)位点变异率在CHB患者组以及C1913A/G (x2=7.963,P＝0.047)在HB-ACLF患者组的各年龄组间的差异有统计学意义。而在基因型C中,未发现任何位点变异率在患者组中各年龄组间的差异有统计学意义。8)多因素分析结果显示,与CHB-M患者相比,年龄(OR值为2.507,95%CI为1.607-3.910,P<0.001)、基因型(OR值为4.247,95%CI为2.572-7.014,P<0.001)以及A1762T/G1764A(OR值为2.370,95%CI为1.487-3.780,P<0.001)、A1846T(OR值为1.842,95%CI为1.185-2.863,P=0.007)和G1896A(OR值为1.617,95%CI为1.031-2.534,P=0.036)变异是HB-ACLF发生的危险因素。年龄大于或等于40岁、基因型B以及发生A1762T/G1764A、A1846T和G1896A变异的患者更易发生HB-ACLF。结论：1)HBV基因型B在HB-ACLF患者中显著高于其他两组患者,提示基因型B与HB-ACLF的发生相关。2) HBV BCP/PC/C区不同位点的变异存在基因型间的差异,因此比较这些位点变异在不同疾病组的发生率时需排除基因型带来的影响。3) HB-ACLF患者中A1762T/G1764A、A1846T和G1896A变异的发生率在基因型B和基因型C中均高于CHB-M患者,提示这四个位点变异可能与HB-ACLF的发生相关。4)多因素分析结果显示HBV基因型B、A1762T/G1764A双变异、A1846T和G1896A变异是HB-ACLF发生的独立相关因素,进一步支持上述结论。这些因素或可作为预测CHB预后的指标。第二章不同基因型、含不同突变位点的1.3拷贝乙型肝炎病毒重组质粒的构建目的：为进一步分析上述有意义位点变异株的生物学特点,分别构建了不同基因型、含有不同突变位点的1.3拷贝HBV重组质粒,为下一步体外实验提供必要的条件。方法：1)以提取的血清中的HBV DNA为模板,设计引物,三段法分别扩增HBV基因序列片段A (nt1063～1982). B (nt2812～1084)和C (nt1063～2839),分别插入pGEM-T Easy载体,构建亚克隆(质粒A、B和C)；利用QuikChange(?) XL Site-Directed Mutagenesis Kit对特定位点进行定点突变,获得突变的质粒,后分别经限制性内切酶双酶切后获得带粘性末端的A、B和C片段(质粒A先后经EcoT22I、EcoRI双酶切；质粒B先后经EcoT22I、EcoO65I双酶切；质粒C先后经HindⅢ、EcoO65I双酶切),与经过EcoRI和HindⅢ双酶切的pUC19载体相连接、转化、筛克隆获得阳性重组质粒。2)利用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ进行双酶切,对重组质粒进行初步鉴定；另外,采用直接测序法对插入片段DNA进行测序做进一步鉴定。结果：在3株病毒的基础上共构建8个pUC-HBV1.3拷贝重组质粒,2株B基因型(其中一株病毒有四个质粒,分别含有nt1762/1764和nt1896位点的野生型和／或突变型不同组合；另一株病毒有2个质粒,分别含有nt1846A或nt1846T)和1株C基因型(有两个质粒,分别含nt2159A或nt2159G),经酶切和核苷酸序列测定结果均与预期相符,并且与相应的野生型质粒相比,无其他突变位点。结论：经体外突变重组,成功构建了不同基因型、含有不同变异位点的1.3拷贝HBV全基因组质粒。第三章不同基因型、含不同突变位点的1.3拷贝乙型肝炎病毒重组质粒体外转染细胞模型的相关生物学特征观察目的：分别比较突变株和相对应的野生株在体外细胞学水平上的生物学特性,试图初步观察它们是如何来影响CHB患者临床变化,从而为HB-ACLF的发病机理提供视角。方法：1)利用QIAGEN Hispeed midi kit中量质粒抽提试剂盒提取已构建好的质粒,以及pSEAP质粒。2)Huh7细胞复苏培养后,按1.5×106细胞/每孔接种至6孔细胞培养皿中,待细胞融合度为80～90%时,利用Lipofectamine2000转染试剂(5u1),分别将质粒(2ug)和pSEAP报告基因质粒(0.1ug)共转染,并设置空白对照。3)利用SEAP试剂盒检测细胞上清中分泌性碱性磷酸酶(SEAP)的表达,以此平衡各组转染效率,并以相应的野生型质粒为对照换算相关结果。收集转染后72小时的细胞培养上清检测HBeAg水平。收集转染后72小时的细胞,抽提HBV复制中间体,Southern印迹杂交检测HBVDNA复制中间体。结果：1)细胞内HBV的复制活性：与相应的野生株相比,转染不同变异模式的重组质粒对细胞内HBV的复制无明显影响。2)细胞培养上清中HBeAg水平：以相应的野生株为对照,发生G1896A单独变异或联合A1762T/G1764A双变异后HBeAg表达缺失,而单独发生A1762T/G1764A双变异的,HBeAg水平下降至野生株的65%左右：引进A1846T变异后,HBeAg水平无明显改变；引进A2159G变异后,HBeAg水平较野生株上调17%左右。结论：1)转染不同变异模式的重组质粒对细胞内HBV复制活性的影响不明显。2) G1896A变异可导致HBeAg表达缺失；A1762T/G1764A变异仅部分下调HBeAg水平；A1846T变异对HBeAg水平影响不明显；A2159G变异对HBeAg水平有轻微上调作用。