骨关节炎是常见的退行性关节疾病,是导致老年人关节功能障碍、生活质量低下的主要原因之一。大量研究表明,骨关节炎的发展是多重环境和基因因素共同作用的结果。NF-κB通路是骨关节炎中炎症反应的主要通路,调控或抑制骨关节炎中NF-κB的过度激活对于抑制软骨炎症、减缓炎症发展进程都有重要意义。既往研究表明,孤儿受体NOR1(即核受体NR4A3)具有调控平滑肌细胞外基质的作用,且在树突状细胞中能通过直接调控IKK的合成调控IKB的水平,从而调控NF-κB通路的活性。但NOR1在骨关节炎中的作用目前尚未明确。因此,本研究旨在研究NOR1在骨关节炎发生发展中的作用,首先研究了 NOR1在骨关节炎中的表达情况,然后应用病毒及siRNA等工具研究过表达或敲低NORI后对骨关节炎中软骨炎症反应多个重要标志蛋白及相关炎症通路的调控作用,进一步完善OA发病机制,希望能为OA治疗寻找新的靶点。本研究共分为以下三部分:1.NOR1在OA病人软骨组织中和体外软骨细胞诱导炎症后的表达情况;2.NOR1在大鼠体内体外骨关节炎模型中对骨关节炎炎症的调控作用;3.NOR1对骨关节炎调控作用的机制研究。第一章NOR1在OA病人软骨组织中和体外软骨细胞诱导炎症后的表达情况目的:探究NOR1在OA病人软骨组织中和体外软骨细胞诱导炎症模型中的表达情况研究方法:收集在浙江大学医学院附属第二医院骨关节病区接受全髋置换手术的髋关节OA患者及接受全髋置换手术的股骨颈骨折患者手术中废弃的关节软骨各10例。通过RT-PCR、Western-blot、免疫荧光等方法对人OA软骨及正常软骨中NOR1及OA标志物(cox2和二型胶原)的表达情况。此外,在体外构建OA炎症模型,即应用IL-1β刺激体外培养的原代大鼠软骨细胞,进行造模,检测炎症指标包括MMP3/9,iNOS,COX2,COL2和SOX9在mRNA和蛋白水平的表达情况,验证模型有效性,并检测在IL-1β刺激不同时间点NORI的表达情况。结果:对临床标本的检测显示,人OA软骨中NORI的mRNA水平和蛋白水平均高于来自年龄性别匹配的股骨颈骨折患者的关节软骨(P<0.05),且免疫荧光结果显示,NOR1的高表达与OA炎症指标COX2的高表达和二型胶原的低表达有共定位关系。大鼠提取的原代软骨细胞经过传代后用于体外实验,软骨细胞的传代次数控制在4代以内。在IL-1β刺激24小时后,我们使用RT-PCR与Western blot检测技术来检测软骨细胞中MMP3/9,iNOS,COX2,COL2和SOX9在mRNA和蛋白水平的表达变化情况。实验结果显示,MMP3/9,iNOS,COX2这些促炎因子在IL-1β刺激后在mRNA和蛋白水平都有明显的表达上升,而COL2和SOX9表达降低。符合OA在人体内的病理变化。然后,我们检测了 IL-1β刺激大鼠软骨细胞不同时间点NOR1的表达情况,发现在IL-1β刺激的早期和后期,NOR1的表达升高较明显(P<0.05)。结论:NOR1在人OA软骨和体外大鼠软骨细胞OA炎症模型中显著高表达。第二章NOR1在大鼠体内体外骨关节炎模型中对骨关节炎炎症的调控作用目的:探究OA中高表达的NOR1在大鼠体内体外骨关节炎模型中对骨关节炎炎症的调控作用研究方法:在体外实验部分,应用siRNA或慢病毒包装NOR1过表达质粒转染体外培养的大鼠软骨细胞,干扰(敲降)或者过表达软骨细胞内NOR1的表达。通过RT-PCR,Western blot,免疫荧光检测技术来检测软骨细胞中NOR1的过表达或干扰效率以及在有无IL-1β诱导炎症情况下MMP3/9,iNOS,COX2,COL2和SOX9等OA关键指标在mRNA和蛋白水平的表达变化情况。在体内实验部分,应用内侧半月板切除术(DMM)对大鼠膝关节进行OA造模,术后一周开始每2周接受一次慢病毒关节腔注射。体内实验共分5组:Sham组大鼠不接收任何注射;Len-NC组为过表达对照组,注射过表达对照病毒;Len-shCon组为敲低对照组,注射敲低对照病毒;Len-OE组为过表达组,注射NR4A3过表达病毒;Len-KD组为敲低组,注射NR4A3敲低病毒。造模后5周处死动物,取材进行SO染色及组织荧光检测。组织荧光检测NOR1干扰或过表达情况及炎症指标COX2的表达情况。结果:体外实验结果显示,NR4A3过表达慢病毒转染后能显著提高IL-1β诱导24小时后大鼠软骨细胞中MMP-3,MMP-9,INOS,COX2的mRNA水平,但对Collagen 2和Sox 9的mRNA水平影响不明显。过表达NR4A3能提高IL-1β诱导24小时后大鼠软骨细胞中MMP-9,INOS,COX2的蛋白水平,对MMP-3的蛋白水平影响不明显,且能显著增强IL-1β诱导24小时后大鼠软骨细胞中Collagen 2和Sox 9在蛋白水平的降解。应用siRNA转染进离体培养的大鼠软骨细胞中后能显著降低IL-1 β诱导24小时后大鼠软骨细胞中MMP-3,MMP-9,INOS,COX2的mRNA水平,此外敲低NR4A3能显著降低IL-1β诱导24小时后大鼠软骨细胞中MMP-9,INOS,COX2的蛋白水平,且能显著缓解IL-1β诱导24小时后大鼠软骨细胞中Collagen2和Sox 9在蛋白水平的降解情况。动物体内实验显示,过表达NR4A3后软骨退变程度较其对照组加重,COX2表达增多,而注射干扰病毒的大鼠膝关节软骨退变程度较其对照组轻,COX2表达减少,体内实验结果与体外实验结果一致。结论:NOR1(NR4A3)在关节炎炎症反应中发挥促炎作用。第三章NOR1对骨关节炎调控作用的机制研究目的:探究NOR1在骨关节炎炎症反应中促炎作用的作用机制研究方法:应用siRNA或慢病毒包装NOR1过表达质粒转染体外培养的大鼠软骨细胞,干扰(敲降)或者过表达软骨细胞内NOR1的表达。通过Western blot技术检测IL-1β诱导后NF-κB通路中关键蛋白P65的磷酸化程度和IKBα的降解程度以及MAPK通路关键蛋白p38,erk,jnk的磷酸化程度。通过免疫荧光技术检测IL-1β诱导后软骨细胞中β65的入核情况。通过双荧光素酶报告基因技术检测NF-κB通路活性。此外,在NR4a3过表达实验中,我们设计了挽救实验,用NF-κB通路特异性抑制剂JSH23处理细胞后,应用RT-PCR及Western blot技术检测IL-1β诱导炎症后软骨炎症及基质降解相关基因MMP9,iNOS,COX2的表达情况。结果:在过表达NR4A3后,相同IL-1β诱导条件下,JNK、erk和p38的磷酸化水平和阳性对照相比没有明显变化,但p65磷酸化水平和IL-1β诱导10分钟后IKBα的降解水平明显增强,p65入核增加,双荧光素酶报告基因结果也显示过表达NR4A3的软骨细胞在IL-1β诱导后NF-κB通路活性更高。在使用JSH-23预处理之后,过表达NR4A3引起的MMP-9,INOS,COX2的增强表达能被缓解,且与对照病毒转染的大鼠软骨细胞接收JSH-23预处理的实验组无明显差异。使用siRNA干扰NR4A3的表达后,相同IL-1β诱导条件下,JNK、erk和p38的磷酸化水平和阳性对照相比没有明显变化,但p65磷酸化水平和IL-1β诱导10分钟后IKBα的降解水平明显减弱,p65入核减少,双荧光素酶报告基因结果也显示敲低NR4A3的软骨细胞在IL-1β诱导后NF-κB通路活性降低。结论:NOR1(NR4A3)通过调节NF-κB通路活性发挥促炎作用。