氧化应激(oxidative stress)是指机体在遭受各种刺激时,体内自由基的产生与抗氧化防御之间严重失衡,氧化应激是导致细胞损伤的最主要原因,会极大地影响多种生物学现象,包括细胞死亡,老化,并伴随许多疾病(包括心血管疾病、自身免疫病、神经退行性疾病、癌症及衰老等)的发生和发展。然而,与氧化应激相关的细胞内的分子机制研究仍然有待深入。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的蓄积正是氧化应激引起细胞损伤的主要原因。ROS是细胞代谢或氧化应激中产生的一类物质,许多哺乳动物细胞在各种细胞外刺激下产生H2O2,如此生成的H2O2作为一种调节多种生物学过程的信号传导分子。ROS包括H2O2、羟自由基等,其中H2O2可作为细胞内第二信使而具有重要的生理功能。当H2O2作为第二信使,氧化效应物以响应被激活的细胞表面受体,其浓度受到严格控制。但是当大量ROS聚集,氧化毒性可引起DNA断裂、蛋白交联和脂质过氧化,导致细胞或组织损伤,引起病理反应。所以需要细胞内的抗氧化体系来维持细胞内氧化还原的动态平衡,从而保护细胞或组织免于氧化损伤。细胞内的抗氧化酶类:哺乳动物有不同种类的过氧化物酶共同发挥抗氧化作用,主要作用于将过氧化氢还原成水。常见有三类过氧化物酶:过氧化氢酶,谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPxs)和过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxins,Prxs)。过氧化氢酶是一种含血红素-H2O2氧化物歧化酶,专门定位于过氧化物酶体中,而该亚细胞器专门用于氧化有机物质,过氧化氢酶通过除去被动扩散进入细胞器的H2O2,或者防止细胞器内H2O2泄漏而发挥作用。谷胱甘肽过氧化物同工酶的划分依据是依其组织和亚细胞分布以及底物特异性来,其中谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX1),是唯一的胞浆酶,利用通过NADPH提供的电子,通过谷胱甘肽-谷胱甘肽还原酶系统减少了过氧化氢的产生。GPX1是一种低水平表达的硒蛋白,在动物细胞里可有可无。在大多数组织中GPX1在胞浆中的浓度比Prx1或Prx2低。Prxs是生物体内有着广泛表达的抗氧化酶,通过催化H2O2和脂质氢过氧化物还原,避免细胞在氧化应激过程中受到进一步损伤。已知的Prxs是分子量大约为22～27 kDa,包括6种哺乳动物同种型的超家族,又可分为非典型2-Cys Prxs(PrxV),典型 2-Cys Prxs(PrxⅠ-Ⅳ)和 1-Cys Prxs(PrxⅥ)三类,典型 2-Cys Prxs在生物体内含量较多,具有独特的催化特性,也是研究得最多的Prxs。而2-Cys Prxs过氧化和过氧化的缓慢逆转可保护H2O2免受破坏而使其有足够时间来完成信号级联反应,当其信使功能完成再由还原后有活性的2-Cys Prxs清除。哺乳动物2-Cys Prxs已被证明能够有效地清除氧化刺激所产生的过氧化氢。该催化H2O2还原反应中还需要硫氧还蛋白,硫氧还蛋白还原酶和还原型辅酶 Ⅱ(triphosphopyridine nucleotide,NADPH)的参与。Prxs 的 ROS 催化效率约105.M-1.S-,相对过氧化氢酶约106.M-1.S-和谷胱甘肽过氧化物酶约108.M-1.S-1等H2O2清除酶的催化效率低。但由于2-Cys Prxs与H2O2具有高亲和力,对H2O2的Km<20 μmol和在细胞中大量存在大多数培养的细胞中每毫克可溶性蛋白中含PrxⅠ-Ⅲ的总量达1～10 μg。故Prxs在机体内担任着重要的ROS清除作用。此外,有研究发现在人类Prx1同时还具有分子伴侣功能,2-Cys Prxs的分子伴侣功能可有效阻止氧自由基诱导的细胞质蛋白聚集而辅助细胞修复,此后过氧化2-Cys Prxs再被硫氧还蛋白(sulfiredoxin,Srx)还原而参与受体信号调节。综上可以推测,2-Cys Prxs在涉及活性氧的系列疾病(如癌症和心血管疾病等)的治疗研究开发中具有巨大的潜力。Prx1就是典型的2-Cys Prxs中的一种,在其结构中有两个具有氧化还原活性的半胱氨酸残基。在催化反应过程中Cys51-SH被H202氧化成为Cys51-SOH,而后与另一分子羧基末端保守的Cys173-SH反应形成分子间二硫化物,这个二硫化物接着被另一种硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)特异性还原,而氧化态Trx又利用NADPH提供的还原电子在硫氧还蛋白还原酶作用下恢复成还原态。通过上述过程,Prx1可以高效地催化过氧化物还原,在氧化应激过程中发挥重要作用。在催化作用过程中,Cys51-SOH偶尔可被H2O2过氧化,形成Cys51-SO2H,这种过氧化会引起Prx1的失活,发挥分子伴侣的作用。同时,这种过氧化失活亦可被Srx扭转。由于原核生物不表达Srx,所以机体抵抗Prx1发生过氧化的发生;而真核生物则依赖这种过氧化,引起特定条件下的H2O2的集聚,并达到向下游传递信号的浓度。Prx1在细胞内除了主要起到抗氧化和调节过氧化氢介导的信号转导作用,还参与细胞周期进程以及发挥分子伴侣作用。其特殊性在于,Prx1的出现可以提供受体介导的信号转导的选择性、特异性和局部控制,即它可以通过短暂的可逆性氧化失活来调节H2O2浓度,而H202要发挥信使功能的前提在于浓度迅速升高达到阈值而不被广泛存在的Prx1破坏。同时有文献报道,当细胞受到通过血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、上皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、T细胞抗原受体(T-cell antigen receptor,TCR)和B细胞抗原受体(B-cell antigen receptor,BCR)的刺激时,与细胞膜相联系的Prx1的第194位酪氨酸可以短暂发生磷酸化,从而引起Prx1的失活。膜周围局部的Prx1失活与局部H2O2累积有关。这种空间上限制性的Prx1失活,为在胞内产生有利的H202浓度梯度,起到了重大作用。这样,信号蛋白在胞膜周围得到集聚并完成信号的传递,同时也不至于在整个细胞内产生高浓度毒性水平的H2O2。我们发现Prx1在机体发挥着重要功能,不仅与组织细胞的各种正常代谢活动息息相关,而且与多种相关疾病的发生发展密切相关。根据文献,过氧化或者酪氨酸磷酸化都可以引起Prx1的失活,然而对Prx1的活性调控的具体机制认识还很缺乏,所以本课题中我们旨在对Prx1在体内的活性状态以及调控机制的进行深入探讨,从而丰富对Prx1的现有认识,进而指导诸多相关疾病研究与诊治。生物体的生命活动与蛋白质的动态变化是密切相关的。随着蛋白质组学研究的深入,我们逐渐认识到很多情况下某些蛋白质的绝对量并不发生明显的变化,机体内大量蛋白总是通过与其它蛋白分子发生相互作用或是通过一系列的翻译后修饰来调控下游分子或者被调控,从而发挥生物学效应。本实验室前期实验通过双向差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)及质谱鉴定,发现在受到氧化刺激的PRAK+/+细胞中,Prx1的磷酸化水平明显升高,而在受到氧化刺激的PRAK--细胞中,Prx1的磷酸化水平变化不大。继而进行体外激酶反应,用Western Blot技术对Prx1的磷酸化水平进行检测,发现p38调节/激活蛋白激酶(p38-regulated/activated protein kinase,PRAK)对Prx1的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基都没有明显的磷酸化现象,并用2D-DIGE技术对Prx1的磷酸化水平进行检测,没有发现明显的差异蛋白点,提示PRAK对Prx1可能没有直接的磷酸化调节作用。接着培养PRAK+/+、PRAK-/-细胞,分别给予200 μmol/LNaASO2刺激45 min后裂解细胞获取蛋白,进行Western Blot检测,结果发现PRAK+/+、PRAK-/-细胞中Prx1的苏氨酸位点均未发生明显磷酸化;PRAK-/-细胞中Prx1丝氨酸位点存在着一定水平的磷酸化,但其水平低于PRAK+/+细胞中Prx1丝氨酸水平,提示PRAK的存在对Prx1的丝氨酸磷酸化有促进作用,但该作用是否受到氧化应激条件的影响,尚不明确。PRAK-/-细胞中Prx1酪氨酸位点未发生明显磷酸化,而PRAK+/+细胞Prx1酪氨酸位点发生明显磷酸化,并且其酪氨酸磷酸化水平在受到氧化刺激后有所增强。提示PRAK的存在对Prx1的酪氨酸磷酸化水平亦有影响,且与氧化刺激过程相关联。考虑到PRAK是MAPK信号通路下游的一个丝/苏氨酸磷酸化激酶,所以推测PRAK对Prx1磷酸化的影响是通过未知的中介蛋白发挥调控作用。由于有文献报道Prx1的活性状态与其磷酸化水平有密切关系,所以我们考虑首先建立完善的Prx1的活性检测体系,通过监测Prx1的活性变化趋势,去研究不同浓度氧化刺激时,Prx1的活性、磷酸化水平及其复合物变化情况,并找出不同活性状态下具有统计学差异的复合物蛋白,完善对Prx1活性调控机制的认识。因此本实验研究思路为,利用免疫共沉淀,温和非变性胶(blue native agarose-acrylamide composite gel electrophoresis,BN-PAGE)结合质谱技术检测氧化刺激过程中NIH3T3细胞内Prx1本身聚合状态及相关复合物蛋白变化情况,并通过由酵母硫氧还蛋白、酵母硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)以及NADPH组成的酵母Trx活性检测系统来检测NIH3T3细胞内Prx1受到梯度亚砷酸钠(NaASO2)刺激后的活性变化趋势,进而研究细胞氧化应激过程中Prx1活性调控的具体机制。通过本课题研究,我们得出以下结论:1.通过优化酵母Trx活性检测系统的反应条件,成功检测到了经原核纯化的低浓度His-Prdx1蛋白的活性变化。2.培养两组NIH3T3细胞,一组给予p38通路抑制剂处理1 h,另一组给予等体积的培养基处理,1 h后分别给予两组细胞200 μmol/L NaASO2刺激45 min后裂解细胞获取蛋白,通过免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)下拉内源性Prx1蛋白,然后经优化的酵母Trx活性检测系统检测其活性,结果发现两组Prx1蛋白的活性变化趋势无差别。提示p38抑制剂并不能抑制Prx1的活性。3.培养 NIH3T3 细胞,分别给予 0、200、300、400、500 和 600 μmol/L NaASO2刺激45 min后裂解细胞获取蛋白,通过IP技术下拉内源性Prx1蛋白,然后经优化的酵母Trx活性检测系统检测其活性,发现随着刺激浓度的增加,Prx1的活性先逐渐增强,后逐渐降低,最后甚至低于未刺激组的活性,其中400 μmol/L NaASO2刺激组的Prx1活性最强,600 μmol/L NaASO2刺激组的Prx1活性几乎低于不刺激组。提示400 μmol/L NaASO2刺激时,Prx1-Cys51-SH还没有被过氧化,仍然以高活性状态的二聚体存在,充分发挥清除过氧化物作用,随着NaASO2刺激浓度逐渐增加,Prx1的氧化还原活性逐渐被抑制,可能与其逐渐被氧化丧失氧化还原活性有关,也可能与其高活性的二聚体相互间形成无活性的多聚体有关。具体机制尚不明确,需要深入研究。4.转染PCDNA3-HA-PRX质粒入NIH3T3细胞,给予梯度NaAS02刺激45 min后裂解细胞获取蛋白,检测经过表达的HA-Prx1与细胞内源性的Prx1是否具有一致的活性变化趋势,此部分仍在进行中。5.分别给予 NIH3T3 细胞 0、200、400 和 600 μmol/L NaASO2刺激 45 min后裂解细胞获取总蛋白,通过IP下拉内源性Prx1蛋白,经Western-blot检测下拉效果。对同一批样品进行SDS-PAGE检测,发现200和400 μmol/L刺激组出现明显差异条带,分子量范围分布在40 kDa和70 kDa左右,其他分组同样位置未发现明显条带;同时600 μmol/LNaASO2组在分子量约55 kDa之上出现明显差异条带。挖出差异条带进行质谱鉴定,找出具有质谱分值的蛋白点。6.分别给予 NIH3T3 细胞 0、200、400 和 600 μmol/L NaASO2刺激 45 min后裂解细胞获取总蛋白,经BN-PAGE检测,发现刺激组与未刺激组存在明显复合物差异条带。5和6的结果提示经NaASO2刺激的NIH3T3细胞中,可能存在与Prx1相互作用的差异复合物。7.培养NIH3T3细胞,分别给予0、200、400和600 μmol/NaAS02刺激45 min后裂解细胞获取总蛋白,检测梯度氧化刺激下Prx1蛋白酪氨酸磷酸化水平变化情况。发现在不刺激组,200和400 μmol/L刺激组几乎检测不到酪氨酸磷酸化,600 μmol/L组检测到明显酪氨酸磷酸化。提示600 μmol/L NaASO2刺激可能引起NIH3T3细胞中Prx1发生酪氨酸磷酸化,从而导致该蛋白失活。