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新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟,是由新城疫病毒引起的一种禽类急性、高度接触性、致死性传染病。该病在世界各地迅速传播,给养禽业带来了巨大损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。目前世界上除部分发达国家采取扑杀措施外,大部分国家主要采用疫苗接种来防治本病。传统的常规疫苗的研制都是以大量培养病原微生物为基础的,这不仅给疫苗的制造带来局限性,同时存在潜在的不安全因素,如病原微生物灭活不彻底,导致强毒散播;致弱的疫苗存在毒力返强问题等。而利用植物生物反应器生产可食(饲)化疫苗,具有成本低廉,安全性好,生产速度快,接种简单以及易于运输等优点,正在引起越来越多的科学家的关注。因此,利用转基因植物研制可食(饲)化疫苗具有重要的意义和实际应用价值。
以本实验室保存的NDV地方分离株HBW-1全基因作为模板,根据GenBank已经发表的序列设计一对引物,采用RT-PCR技术人工扩增出了NDV HBW-1株F基因,将其克隆到载体中,再转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,得到的转化子经分子量比较、PCR鉴定和酶切分析筛选阳性克隆。结果表明,得到的阳性重组子(pMD19-T)中含有F基因,且是正确插入到载体中的。F基因的测序结果与B1,BP01,LaSota,JS-2,CH2000等基因序列相比,核苷酸序列同源性为83.3%-99.1%,氨基酸同源性为87.9%-99.1%。
本研究选用新城疫病毒中毒力和免疫保护的关键蛋白-融合蛋白F全长基因作为目的基因,将其克隆到含CaMV35S启动子控制下的植物表达载体pBI121中,构建了植物表达载体pBI121-F,经酶切和PCR鉴定,表达载体的构建完全正确。利用改进的冻融法将其导入农杆菌LBA4404,构建了植物双元表达载体。
利用构建好的表达载体,通过农杆菌LBA4404介导,转化马铃薯愈伤组织,通过抗生素抗性筛选,共获得32株抗性苗。对再生植株进行PCR分析,初步证实外源基因己经整合进马铃薯基因组中。获得阳性转化再生植株1株,为利用马铃薯作为生物反应器生产新城疫新型食用性疫苗作了探索性的基础研究。