论文部分内容阅读
癌症是严重威胁人类健康的重大疾病之一，近年来癌症的发病率和死亡率呈现出明显上升趋势，化疗是目前癌症治疗的主要手段之一。多西他赛(Docetaxel，DTX)为临床上广泛应用的抗肿瘤药物，被广泛用于包括卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等在内的多种肿瘤的治疗。由于DTX溶解性较差，目前上市制剂如泰索帝(@)(Taxotere(@))和多帕菲(@)(Duopafei(@))等均以高浓度的非离子表面活性剂Tween-80作为增溶剂;DTX自身在体内的非选择性分布和增溶剂的使用使得该制剂毒副作用较大，限制了其临床应用。
近年来，药物-聚合物结合物应用于难溶性抗肿瘤药物递送受到药学研究者越来越多的关注。将小分子难溶性药物通过可降解的化学键和水溶性大分子聚合物共价连接制备的药物-聚合物结合物具有两亲性，可以在水性介质中自组装形成以难溶性药物为疏水内核，水溶性聚合物为亲水外壳的胶束。与难溶性抗肿瘤药物增溶制剂相比，抗肿瘤药物-聚合物结合物胶束具有:载药量高、避免有毒增溶剂使用、延长药物在体内的半衰期、在递送过程中无药物突释风险、可通过EPR效应靶向于肿瘤组织等诸多优点。聚谷氨酸-紫杉醇结合物(polyglutamicacid-paclitaxelconjugates，PGA-PTX)的研究已经进入临床Ⅲ期阶段，研究结果表明，与PTX制剂Taxol(@)相比，PGA-PTX结合物的副反应更小、治疗效果更优、且易于给药、病人顺应性更好。因此，药物-聚合物结合物用于难溶性抗肿瘤药物递送是目前药剂学领域研究热点之一。
聚合物载体材料的选择对于药物-聚合物结合物的设计和制备十分关键。羧甲基壳聚糖(Carboxymethylchitosan，CMCS)是一种天然大分子多糖衍生物，具有优良的理化性质和生物学性质，CMCS分子中含有很多活性基团（氨基、羧基和羟基），便于偶联药物。因此CMCS是合成药物-聚合物结合物的理想载体材料之一。本文选用CMCS为聚合物载体和DTX偶联制备多西他赛-羧甲基壳聚糖结合物(Docetaxel-Carboxymethylchitosanconjugates，DTX-CMCS)，该结合物在水中可以自组装形成DTX-CMCS胶束，提高DTX的溶解度，避免Tween-80的使用，同时可利用EPR效应增加药物在肿瘤组织的蓄积。为了进一步增加药物在肿瘤组织中选择性蓄积能力和抗肿瘤效果，本文选择靶向因子修饰DTX-CMCS获得了具有肿瘤主动靶向作用的药物-聚合物结合物。研究证明含天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arginine，NGR)结构的寡肽可以特异性地和肿瘤新生血管内皮细胞和某些肿瘤细胞表面上高度表达的APN/CD13受体结合。与线性的NGR寡肽相比，环合NGR寡肽(cNGR)对CD13受体的选择性和亲和性更强。因此，本文选择cNGR为靶向基因子修饰DTX-CMCS获得了双靶向DTX-CMCS-PEG-NGR结合物(DTX-CPN)，该结合物可以靶向于CD13过表达的肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞，从而实现一种靶向基团修饰，双靶向递送药物的效果，有利于进一步提高药物治疗作用。
本课题研究内容主要包括两部分:(1)DTX-CMCS结合物胶束的研究;(2)NGR介导的双靶向DTX-CPN结合物胶束的研究。本文对两种结合物胶束的理化性质、稳定性、体外和体内抗肿瘤效果以及最大耐受剂量(Maximumtolerateddose，MTD)分别进行了评价。主要研究方法和结果如下:
1.DTX-CMCS结合物胶束的研究
本文首先制备了DTX-CMCS结合物胶束(DTX-CMCS胶束)并对其理化性质和抗肿瘤效果进行了评价。首先，利用丁二酸酐和DTX的2’位羟基反应，得到羧基化DTX。然后羧基化DTX在EDC·HCl和sulfo-NHS的催化下和CMCS分子中氨基反应，获得DTX-CMCS结合物(DTX-CMCS)。反应完成后，通过透析除去未反应的试剂和有机溶剂，随着透析的进行，DTX-CMCS在水中自组装形成以DTX为疏水内核，CMCS为亲水外层的胶束。通过质子核磁共振光谱(1H-NMR)方法对DTX-CMCS结构进行表征。采用透射电镜(Transmissionelectronmicroscopy，TEM)观察了DTX-CMCS胶束的外观形态，动态光散射技术(Dynamiclightscattering，DLS)测量了DTX-CMCS胶束的粒径和电位。此外，通过测量DTX-CMCS胶束与不同介质孵育后之后DTX的释放特性，考察了DTX-CMCS胶束的稳定性。采用了噻唑蓝比色法(MTT法)和Hoechst染色的方法考察了不同DTX制剂的体外抗肿瘤效果。在药效学研究中，评价了DTX-CMCS胶束在荷黑色素瘤小鼠中的抗肿瘤效果。为了评价DTX-CMCS胶束静脉注射给药的安全性，本文还测定了DTX-CMCS胶束和市售制剂Duopafei(@)的最大耐受剂量(Maximumtolerateddose，MTD)。
实验结果表明，DTX成功地连接到大分子多糖CMCS上。制得的DTX-CMCS胶束外观形态圆整、呈球形且分散性良好，粒径为127.2±5.6nm，Zeta电位为-25.6±1.7mV，载药量为20.9±0.7％。稳定性考察结果显示，DTX-CMCS胶束与不同介质孵育后，药物释放均较少，其中与血浆孵育48h后，药物释放仅为12.46％，这说明该DTX-CMCS胶束在血浆中稳定性良好。MTT实验结果表明，DTX-CMCS胶束在两种肿瘤细胞中(HepG2和B16F10)均显示出明显的细胞毒性(p＜0.01)。细胞凋亡结果表明，DTX-CMCS胶束可有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡。体内抗肿瘤实验结果显示，DTX-CMCS胶束可以更有效地抑制小鼠黑色素瘤的生长并延长小鼠生存时间，其抗肿瘤效果优于Duopafei(@)(p＜0.01)。MTD实验结果表明，Duopafei(@)的MTD约为50mg/kg，而DTX-CMCS胶束的MTD≥250mg/kg，这说明与DTX-CMCS胶束的体内应用安全性将优于Duopafei(@)。综上所述，DTX-CMCS胶束是一种很有应用前景的DTX递送体系，值得进一步研究。此外，CMCS理化性质和生物学性质优良，作为聚合物载体材料有望用于更多抗肿瘤药物-聚合物结合物的研究和开发。
2.NGR介导的双靶向DTX-CPN结合物胶束的研究
为了进一步增加DTX-CMCS胶束靶向于肿瘤组织的能力，本文选择cNGR作为靶向因子修饰DTX-CMCS制备了双肿瘤靶向DTX-CPN胶束并对其理化性质和抗肿瘤活性进行了研究。首先，采用两端活化的PEG(NHS-PEG-NHS)连接cNGR和CMCS制备了靶向载体材料:CMCS-PEG-NGR(CPN)。然后将羧基化DTX通过酰胺键和CPN连接，即可获得DTX-CPN。同时，本文将DTX偶连到CMCS-PEG分子上制备了DTX-CMCS-PEG结合物(DTX-CP)作为非NGR修饰对照胶束。通过1H-NMR验证DTX-CPN的结构。由于具有两亲性，DTX-CP和DTX-CPN可在水中自组装形成以DTX为疏水内核、CPN(或CP)为亲水外层的胶束。本文采用TEM观察了DTX-CP和DTX-CPN胶束的外观形态，并通过DLS技术测定了两种胶束的粒径和电位。通过测定DTX-CPN胶束在不同介质中的药物释放情况，考察了该胶束制剂的稳定性。为了验证cNGR修饰的靶向作用，选择了不同CD13受体表达程度的细胞进行了细胞摄取实验。通过细胞毒性实验和细胞凋亡实验考察了DTX-CPN胶束的体外抗肿瘤效果。采用小鼠黑色素瘤模型评价了DTX-CPN胶束体内抗肿瘤效果并与DTX-CP胶束和Duopafei(@)的治疗效果进行比较。为了评价DTX-CPN胶束静脉注射给药的安全性，本文还测定了DTX-CPN胶束的MTD。
本部分成功制备了单纯PEG化的DTX-CP和cNGR靶向修饰的双靶向DTX-CPN。TEM观察结果显示，DTX-CP和DTX-CPN在水中均可自发形成外观形态圆整、球形且分散性良好的胶束。粒径测量结果显示:DTX-CP和DTX-CPN胶束的粒径分别为130.5±8.2nm和142.9±5.6nm，电位结果显示:DTX-CP和DTX-CPN胶束的电位分别为-20.86±1.8mV和-15.57±2.2mV。稳定性考察结果表明两种胶束在血浆中稳定性均良好，与血浆孵育48h之后，药物释放分别为10.75±0.41％(DTX-CP)和10.34±0.39％(DTX-CPN)。细胞摄取实验结果表明，cNGR修饰赋予了DTX-CPN胶束主动靶向于CD13阳性细胞的能力。细胞毒性结果表明，DTX-CPN胶束对CD13阳性的B16F10细胞和HUVEC的细胞毒性高于同浓度的DTX-CP胶束(p＜0.05)。体内抗肿瘤实验结果显示，DTX-CPN胶束能更有效地抑制肿瘤的生长并延长荷瘤小鼠的生存时间，其抗肿瘤效果优于DTX-CP胶束和市售制剂Duopafei(@)(p＜0.01)。MTD实验结果表明，DTX-CP和DTX-CPN胶束的MTD均介于300～350mg/kg之间，说明两种结合物体内应用安全性良好。综上所述，双靶向DTX-CPN胶束能够有效地靶向CD13阳性的肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞，抗肿瘤活性高且毒副作用低。DTX-CPN胶束作为一种双靶向DTX递送体系，具有良好的应用前景，值得进一步研究。