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丹参酮是常用药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza)中一类二萜醌类化合物,为丹参主要药效成份,在治疗心脑血管疾病方面具有极其重要的药用价值。在植物中,二萜类化合物的代谢受到多种酶的调控,其中异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)是其下游代谢途径的总开关,编码该酶的基因目前已经成为大肠杆菌中异戊二烯类化合物代谢工程的一个有效靶点。本研究利用Gateway技术构建SmIPI基因的干扰表达载体,并利用根癌农杆菌介导转化紫花丹参外植体,经激素诱导及抗性筛选、Egfp荧光标记检测、目标基因表达分析筛选,获得SmIPI基因表达抑制的丹参植株。并利用GC-MS检测以及LC-MS检测方法,初步分析了SmIPI基因表达对丹参体内MEP和MVA途径上初生代谢和次生代谢产物积累的影响,为完全解析SmIPI在MEP和MVA途径中的作用方式提供基础研究。主要研究结果如下:1.通过Gateway技术克隆及亚克隆方法,将从SmIPI1和SmIPI2中分别扩增到特异性基因片段分别重组进入专用于RNA干扰研究的Gateway双元表达载体pK7WIWG2D(II)。重组质粒经过特异性引物的菌液PCR反应及测序验证,表明干扰表达载体构建成功,获得SmIPI1基因干扰表达载体RSi1A、RSi1B,以及SmIPI2基因干扰表达载体RSi2A、RSi2B。2.利用农杆菌介导遗传转化,建立了以丹参叶盘为外植体,含400 mg/L Cef、1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的MS为诱导培养基,30 mg/L Kan为抗性筛选标记,含0.5 mg/L IBA、0.5 mg/L NAA的1/2MS为生根培养基的SmIPI基因干扰的丹参植株再生体系。转化植株根尖在荧光显微镜下呈强烈绿色荧光,且干扰型植株SmIPI1和SmIPI2基因的相对表达量分别下调64%-82%和23%-78%。3.使用GC-EI-MS/MRM和UPLC-ESI-MS/MRM检测并分析了SmIPI1-RNAi、SmIPI2-RNAi及V0对照株系丹参植株地上部分中植物甾醇和地下部分中以丹参酮为主的二萜类化合物积累差异,结果表明,与对照组V0株系相比,SmIPI1-RNAi株系菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇总含量降低10.73%,丹参酮IIA等10种二萜类化合物总含量水平降低49.76%,差异极显著。而SmIPI2-RNAi株系中,菜油甾醇和豆甾醇含量与对照组V0株系间无统计学差异,三种植物甾醇总含量下降幅度为6.59%,二脱氢丹参酮IIA、丹参酮IIB、15,16-二羟基丹参酮I、丹参酮I、1,2-二羟基丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA含量与对照组V0株系相比无统计学差异,所测10种二萜类化合物总积累水平下降32.35%。综合研究结果认为,SmIPI1与SmIPI2协同调节MEP质体途径上二萜等的代谢,而SmIPI1在其中起到主要作用,SmIPI1还兼顾胞质中MVA途径上IPP和DMAPP的异构化。