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目的本实验通过原代培养的脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelialcell，BMEC）和星形胶质细胞（astrocyte cell，AC）共培养建立体外血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB）模型，观察川芎嗪作用于此模型后，模型的跨内皮细胞间电阻(TEER)、川芎嗪促荧光黄透过率、川芎嗪的透过率以及体外BBB模型上紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达变化，研究川芎嗪对体外BBB模型的通透性影响，探讨川芎嗪透过BBB的部分作用机制。方法1.取新生SD大鼠两侧大脑皮质，通过胰蛋白酶消化及200目筛网过滤，利用差速贴壁去除大部分杂细胞，进行原代大鼠AC的分离。用含20%胎牛血清的DMEM培养基每3d换液培养。倒置显微镜观察不同阶段细胞生长状态。用荧光免疫组化法鉴定AC表面特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达，荧光显微镜观察并拍照。2.取新生SD大鼠两侧大脑灰质，通过两次酶消化及梯度离心取得大鼠脑微血管段，种植于预先用1%明胶预包被的一次性培养瓶中，用添加了肝素及内皮细胞生长添加物（Endothelial Cell Growth Supplement，ECGS）的DMEM/F12完全培养基进行培养，排除杂细胞对BMEC的影响。用Millicell-ERS-2仪检测跨内皮细胞间电阻(TEER)、荧光免疫组化鉴定BMEC表面Ⅷ因子相关抗原表达，以确定培养的细胞种类。3.将BMEC和AC按一定顺序双面种植于Transwell通透性支持物微孔膜上，通过不同时间段TEER的测定、4h的液面试漏试验以及BBB的特征性指标γ-GT和ALP的活性测定，对BBB体外模型的建立进行评价。4.将BBB分为正常对照组、川芎嗪给药组，其中川芎嗪给药设置6个剂量，分别是208.69μg/mL、104.35μg/mL、52.17μg/mL、26.09μg/mL、13.04μg/mL、6.52μg/mL，MTT法分别检测川芎嗪对BMEC和AC安全浓度，综合结果确定川芎嗪给药剂量。5.按照安全浓度的筛选，设正常对照组、川芎嗪高剂量组、川芎嗪中剂量组、川芎嗪低剂量组。分别于2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h测量TEER值，比较不同时间TEER值差异和同一时间不同组TEER值差异。以此确定川芎嗪透过BBB与直接促进BBB模型紧密连接开放有无直接关系。6.川芎嗪作用BBB24h后，吸去Transwell小室内外侧的培养基，将含有终浓度100μg/mL荧光黄的PBS加入至Transwell小室内侧，外侧添加PBS保持内外液平一致，4h后收集外侧液体，荧光分光光度计测定吸光度。计算各组荧光黄透过率，比较差异，确定川芎嗪对BBB通透性的影响。7.川芎嗪作用BBB24h后，吸取每组Transwell小室外侧培养液，高效液相色谱法分析川芎嗪的透过，检测其透过量，比较各组川芎嗪的透过率。8.将BBB分为正常对照组、川芎嗪高剂量组、川芎嗪中剂量组、川芎嗪低剂量组，分别提取各组细胞总蛋白，western blotting检测各组Occludin、ZO-1表达。探讨川芎嗪对体外BBB紧密连接蛋白表达的影响。结果1、AC原代培养：倒置显微镜观察第3d和第7d星形胶质细胞形态明显，有长而分支的突起，伸展在相邻神经细胞的胞体及其突起之间，符合AC的形态特征。经GFAP免疫荧光染色后，细胞胞浆及突起发出明显的绿色荧光，细胞轮廓清晰。2、BMEC原代培养：倒置显微镜观察第3d、7d、14d、16d细胞形态，细胞呈短梭形、多角形，可见典型的铺路石征象。进行Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色后观察发现，细胞与细胞间紧密连接，细胞胞浆都发出明显的绿色荧光。3、体外模拟BBB模型的鉴定：倒置显微镜观察Transwell上细胞形态，BMEC贴壁致密融合生长，形态清晰可见，隐约可见底层AC细胞。共培养模型组与单层BMEC组的TEER值都随着时间呈现上升趋势，共培养模型组较单层BMEC组更为明显。到达72h左右时，两组TEER值都进入稳定状态。4h液面试漏实验阳性。共培养细胞的γ-GT、ALP含量较单层BMEC显著增高。4、川芎嗪安全浓度筛选：13.04μg/mL～208.69μg/mL剂量范围的川芎嗪对AC和BMEC均有促进生长的作用。按剂量梯度确定208.69μg/mL、52.17μg/mL、13.04μg/mL作为高、中、低剂量组。5、川芎嗪对体外模拟BBB模型通透性影响：（1）BBB模型的TEER在加药后随着时间的延长均发生了不同程度的降低，尤以川芎嗪高剂量组最为显著。（2）液相色谱法分析川芎嗪高、中、低剂量组均有透过，且透过率分别为43.4%、38.5%、36.4%。（3）荧光黄透过实验结果显示，正常对照组荧光黄透过率为4.9%，川芎嗪高、中、低剂量组促荧光黄透过率分别为15.7%、12.1%、8%。（4）western blotting检测各组Occludin、ZO-1表达结果显示，Occludin和ZO-1不仅在体外BBB模型表达，而且在构成模型的AC与BMEC上都有表达，主要以BMEC为主；加入不同剂量川芎嗪后Occludin和ZO-1的表达都不同程度的降低。结论1、原代细胞的培养及模型建立：BMEC和AC的原代培养通过细胞形态学及特异性抗体免疫荧光染色的鉴别，证明原代培养是成功的；体外通过Transwell建立BMEC和AC共培养以建立BBB模型，经TEER及特征性酶检测结果，说明模型建立是成功的；2、川芎嗪对体外模拟BBB模型通透性影响：正常BBB加入不同剂量川芎嗪后，TEER随着时间的延长均发生了不同程度的降低，说明川芎嗪可以引起紧密连接开放；荧光黄透过实验结果显示，不同剂量川芎嗪作用于正常BBB后，荧光黄的透过率随着川芎嗪剂量的增大而增大；通过液相色谱分析，川芎嗪可以直接透过体外BBB模型，且透过率随着加药量增加而增加。3、川芎嗪对紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达的影响：通过western blotting检测，Occludin、ZO-1两种蛋白在AC及BMEC上都有表达，且在体外BBB模型中加入不同剂量川芎嗪后，Occludin、ZO-1蛋白表达均不同程度降低。说明川芎嗪可以通过降低紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达从而增强BBB的通透性。