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肝细胞癌(HCC)发病率逐年增加,已经成为威胁人类生命健康的重大疾病。HCC的早期诊断包括影像学(超声、CT和磁共振)和血清学检测等,由于影像学检测成本较高,血清学特异性肿瘤标志物的检测越来越受到人们的重视,其中甲胎蛋白(AFP)是当前诊断HCC最特异的标记物之一,但由于个体的差异,AFP检测会出现假阳性或假阴性的结果,因此我们需要寻求新的生物标志物与AFP联合诊断HCC,以提高诊断的准确性。近年,胰岛素样生长因子(IGF)家族蛋白成为HCC发展和进展中的重要因子,其中胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)在HCC病人血清中表达增高,与病人的不良预后相关,但IGFBP2在HCC中的作用机制尚不清楚。研究表明,IGFBP2可通过IGF非依赖途径介导细胞生长,蛋白的C端有Arg-Gly-Asp(RGD)结构域与整合素受体β1(Integrinβ1)相互作用,Integrinβ1的活化状态下,FAK发生磷酸化,可以介导下游信号通路的激活,如JNK通路、Rac1通路和Mek/Erk通路等,提示Integrinβ1可能作为其受体在HCC增殖中发挥作用。在HCC中,早期生长反应因子1(Egr-1)的表达与细胞的增殖密切相关,研究表明Egr-1在HCC中高表达,可以通过调控下游基因,发挥着重要的促进肿瘤生长、浸润和转移的作用。本课题拟采用HCC患者临床血清及肿瘤样本、外源重组IGFBP2(r IGFBP2)体外刺激HCC细胞株为研究对象,利用Western blot、CCK-8、Transwell、免疫共沉淀(Co-IP)、免疫荧光等实验技术,研究IGFBP2在HCC细胞增殖、迁移和侵袭中的作用,并进一步探讨IGFBP2促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。该研究将为揭示HCC新的病理机制和寻找新的药物靶点提供重要依据。目的:1.观察IGFBP2在HCC临床患者血清以及肝脏肿瘤组织中的表达。2.观察r IGFBP2刺激下HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,明确IGFBP2在HCC细胞中的作用。3.观察r IGFBP2刺激下HCC细胞Integrinβ1的活化及其与p-FAK的共表达,检测p-Erk、p-AKT和Egr-1的表达,部分揭示IGFBP2促进细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法:1.收集HCC患者和健康人血清和肝脏肿瘤组织样本,利用蛋白芯片法检测HCC患者血清中IGFBP2的表达,HE染色分析HCC患者肿瘤组织与癌旁组织的病理学特征,免疫组化法及Western blot法检测HCC患者肿瘤组织及癌旁组织中IGFBP2、Integrinβ1和Egr-1蛋白的表达。2.选用HCC细胞株Hep G2细胞和HCC-LM3细胞,采用CCK-8法和Transwell法分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力,Western blot及免疫荧光法检测Integrinβ1蛋白的活化,Western blot法检测Integrinβ1、p-FAK、Egr-1、p-Erk和p-AKT的表达,免疫荧光法和Co-IP法检测Integrinβ1与p-FAK的共表达。结果1.IGFBP2在HCC患者血清及肿瘤组织中表达升高采集临床HCC患者及健康人外周血血清样本,利用蛋白芯片法检测其中IGFBP2的表达,结果表明,IGFBP2在HCC患者血清中含量高于健康人;将手术切除的HCC患者肿瘤组织进行石蜡包埋、切片,采用HE染色法观察组织病理特征,结果发现癌旁组织中肝细胞呈肝索状排列,肿瘤组织中肝细胞排列无规则并且出现炎症细胞浸润、肝细胞肥大、胞核变大以及胞浆HE染色变浅,肝组织出现假小叶。采用免疫组化法和Western blot检测HCC患者肿瘤组织及癌旁组织中IGFBP2、Integrinβ1、Egr-1和p-FAK蛋白的表达,结果显示,IGFBP2、Integrinβ1、p-FAK和Egr-1在HCC患者肿瘤组织中的表达高于癌旁组织。2.外源r IGFBP2促进HCC细胞株增殖、迁移和侵袭选用HCC细胞株Hep G2细胞和HCC-LM3细胞,利用CCK-8检测不同浓度r IGFBP2(15.625 ng/m L、31.25 ng/m L、62.5 ng/m L、125 ng/m L、250 ng/m L)对Hep G2细胞和HCC-LM3细胞增殖的影响,结果显示62.5 ng/m L、125 ng/m L、250ng/m L浓度的r IGFBP2刺激均可显著促进细胞增殖。Transwell实验检测不同浓度r IGFBP2对Hep G2细胞和HCC-LM3细胞迁移和侵袭的影响,结果表明,不同浓度r IGFBP2均可显著促进Hep G2细胞和HCC-LM3细胞的迁移和侵袭。3.r IGFBP2可活化HCC细胞中Integrinβ1,促进Integrinβ1和p-FAK的共表达,激活Erk和AKT信号通路选用亚适浓度125 ng/m L r IGFBP2刺激Hep G2细胞,Western blot实验表明,胞内Integrinβ1、Egr-1、p-FAK、p-Erk和p-AKT蛋白表达从30 min开始升高,4h或12 h达到高峰,随后逐渐降低。用r IGFBP2刺激HCC细胞30 min,利用免疫荧光法检测Hep G2细胞和HCC-LM3细胞中活化的Integrinβ1表达,利用免疫荧光法和Co-IP法检测Hep G2细胞中Integrinβ1和p-FAK的共表达变化,结果显示,r IGFBP2作用Hep G2细胞和HCC-LM3细胞30 min时,Integrinβ1活化,并且与p-FAK的共表达升高,提示r IGFBP2可活化HCC细胞中Integrinβ1,促进Integrinβ1和p-FAK的共表达,激活Erk和AKT信号通路。结论:1.IGFBP2在HCC患者血清中的含量大于健康人,IGFBP2、Integrinβ1及Egr-1在HCC患者的肿瘤组织中的表达大于癌旁组织。2.外源r IGFBP2可以促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭,可能与r IGFBP2活化Integrinβ1,促进Integrinβ1和p-FAK的共表达,激活Erk和AKT信号通路有关。