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结球甘蓝(Brassica olerecea var.capitata)是我国的一种重要蔬菜,栽培面积已达几十万公顷。生产上结球甘蓝虫害发生相当严重,造成了产量和品质的损失。为害结球甘蓝的主要害虫是鳞翅目的昆虫,其中主要包括菜粉蝶和小菜蛾等。 由于在已有的种质资源中很难找到可用的抗虫材料这使得蔬菜常规抗虫育种受到了限制。利用基因工程技术手段培育抗虫蔬菜新品种是农业发展的一个重要方向。基因工程技术不仅安全有效而且投资少、见效快、特异性杀灭害虫和不污染环境。植物基因工程为抗性育种提供了一条有效的方法。人们已从细菌中分离得到苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白基因(Bt)。其蛋白产物对鳞翅目昆虫具有特异的毒杀作用而对高等动物和人无害。因此,将Bt基因转入结球甘蓝而获得抗虫材料而成为可能。 本研究内容主要涉及转化获得转基因甘蓝,对己获得的卡那霉素抗性植株的分子检测,转化植株的抗虫鉴定,同时对外源基因在转化植株自交后代的遗传分离情况进行了研究。取得的主要研究结果如下: 1 10mg/L-15mg/L的卡那霉素(Kanamycin,Km)可以有效抑制“牛心”甘蓝下胚轴绿芽的再生,使其不能分化出芽或分化出白色或紫色芽。 2 头孢霉素(Cefotaxime,Cef)对“牛心”甘蓝下胚轴绿芽的诱导有较强的抑制作用。随着头孢霉素浓度的增加,抑制作用加剧。 3 共培养时间影响结球甘蓝转化频率,本实验中共培养48h得到的抗性芽较多。 4 转化获得“牛心”结球甘蓝植株。经PCR检测,证明Bt基因已经整合到结球甘蓝基因组中。 5 提取部分T0代“中甘八号”PCR阳性植株的基因组DNA,经Southern杂交分析,证明Bt基因已经整合到结球甘蓝基因组中。 6 “中甘八号”中经Southern杂交检测的阳性植株,在蕾期进行自交,收获T1代种子。对T1世代植株进行苗期卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增分析鉴定,发现Bt基因和NPTII基因在植株体内遗传符合显性单基因孟德尔遗传规律。 7 分别对“中甘八号”转化的T0、T1代植株进行室内抗虫鉴定,发现Bt转基因植株的抗虫性均得到提高,但不同植株之间存在一定差异。