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背景与目的心力衰竭(心衰,heart failure,HF)患者在接受心脏或非心脏手术时,易发生围术期心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤,是临床麻醉医师需要面对的一个棘手问题。本课题组前期研究发现,细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路活化在吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)减轻离体心衰大鼠心肌I/R损伤中发挥重要作用。同时在心衰心肌细胞中miR-133b-5p下调最明显,且这种下调可被MPC所拮抗。Fas是miR-133b-5p的关键靶基因,MPC减轻心肌I/R损伤可能是通过上调mi R-133b-5p后抑制Fas介导的心肌细胞凋亡。受体相互作用蛋白(the receptor-interacting protein,RIP)是细胞应激的重要调节因子,与死亡域受体Fas相互作用,调控心肌细胞凋亡及坏死。鉴于以上研究背景,本研究进一步探讨ERK信号通路与mi R-133b-5p靶向调控Fas及RIP信号在MPC减轻心力衰竭大鼠心肌I/R损伤中的作用机制,以及两者之间的相互作用,为研究MPC在心力衰竭大鼠心肌保护机制中提供新的理论依据。方法1.在体水平健康成年雄性SD大鼠,200-230g,尾静脉注射盐酸多柔比星2mg/kg,1周1次,连续6周,制备慢性心力衰竭模型,在第8周末将造模成功的50只大鼠随机分为5组(n=10):(1)假手术组(Sham组)、(2)缺血再灌注组(I/R组)、(3)吗啡预处理组(MPC组)、(4)ERK抑制剂PD98059+吗啡预处理组(MPD组)、(5)PD98059对照组(PD组)。采用开胸结扎左冠状动脉前降支(LAD)缺血30 min、再灌注2 h的方法制备大鼠I/R损伤模型。除Sham组只缝线,不结扎LAD外,其余各组均进行LAD结扎。MPC组于缺血前股静脉输注吗啡0.1mg/kg,输注5 min后停止输注5 min,重复3次进行后进行I/R损伤。MPD组于吗啡预处理前15 min股静脉输注PD98059 0.5mg/kg至缺血开始后5 min,共50 min,然后制备I/R损伤模型。PD组持续输注0.5mg/kg PD98059至缺血开始后5 min,共50 min,然后制备心脏I/R损伤模型。以上各组分别于基础值、再灌注5和10 min时取静脉血测乳酸脱氢酶(LDH)活性;再灌注结束后TTC染色检测梗死区体积(IS)、缺血危险区体积(AAR)及IS/AAR比值;qRT-PCR检测miR-133b-5p及Fas;Western blot检测Fas、ERK、GSK-3β和RIP1/RIP3蛋白表达。2.心肌细胞水平乳鼠原代心肌细胞给予阿霉素处理24 h,采用随机数字表法将细胞分为7组(n=4):(1)空白组(Control组)、(2)缺氧复氧组(H/R组)、(3)吗啡预处理组(MPC组)、(4)miR-133b-5p过表达+缺氧复氧组(agomiR-133b+H/R组)、(5)过表达阴性对照+缺氧复氧组(agomiR-NC+H/R组)、(6)miR-133b-5p抑制剂+吗啡预处理+缺氧复氧组(ant-miR-133b+MPC组)、(7)抑制剂阴性对照+吗啡预处理+缺氧复氧组(ant-miR-NC+MPC组)。除Control组细胞正常培养外,其余各组均行缺氧4 h复氧2 h处理;MPC组细胞于缺氧前用含1mmol/L吗啡的培养液孵育10 min;agomiR-133b+H/R组和agomiR-NC+H/R组分别于H/R前24 h转染终浓度均为50 nmol/L的miR-133b-5p agomir或agomir-NC;ant-miR-133b+MPC组和ant-miR-NC+MPC组分别于MPC前24 h转染终浓度均为100 nmol/L的miR-133b-5p antagomir或antagomir-NC。各组按照上述处理结束后,采用CCK-8法测定细胞活力;LDH试剂盒测定细胞培养液中LDH活性;FITC Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡及坏死;qRT-PCR检测miR-133b-5p与Fas表达;Western blot检测Fas、ERK、GSK-3β和RIP1/RIP3蛋白表达。结果1.在体水平与I/R组比较,MPC组IS和IS/AAR减少,再灌注5和10 min时LDH活性降低,mi R-133b-5p、p-ERK1/2及p-GSK3β蛋白表达上调,Fas mRNA/蛋白及RIP1/3蛋白水平降低(P<0.05),AAR差异无统计学意义(P>0.05);与MPC组比较,MPD组IS和IS/AAR增加,再灌注5和10 min时LDH活性升高,miR-133b-5p、p-ERK1/2及p-GSK3β蛋白表达下调,Fas mRNA/蛋白及RIP1/RIP3蛋白水平增高(P<0.05),AAR差异无统计学意义(P>0.05),PD组差异无统计学意义(P>0.05)。2.心肌细胞水平与H/R组相比,agomiR-133b+H/R组和MPC组可显著增加心肌细胞活力,降低LDH活性及心肌细胞凋亡率/坏死率,显著上调mi R-133b-5p、p-ERK1/2及p-GSK3β蛋白表达,降低Fas mRNA/蛋白及RIP1/3蛋白水平,(P<0.05),而agomiR-NC+H/R组差异无统计学意义(P>0.05);与MPC组相比,ant-miR-133b+MPC组则显著降低了心肌细胞活力,增加心肌细胞培养液中LDH活性及心肌细胞凋亡率/坏死率,降低miR-133b-5p、p-ERK1/2及p-GSK3β蛋白表达水平,升高Fas mRNA/蛋白及RIP1/RIP3蛋白水平(P<0.05),而ant-miR-NC+MPC组差异无统计学意义(P>0.05)。结论吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤,其机制可能涉及ERK信号通路和miR-133b-5p靶向调控Fas,且两者间存在着相互作用,共同作用于下游的RIP信号。