大电导钙依赖性钾通道(Large conductance calcium and voltage-dependentpotassium,BKCa通道)分布广泛,受氧化、磷酸化、胞内钙浓度等因素的调节,在血管、神经内分泌等生理、病理过程中发挥重要的作用。过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）属于活性氧（ROS）的重要成员,既是细胞损伤的因素,又是胞内的第二信使。PTEN具有负调控PI3K的作用,能调节细胞的大小、生长、凋亡、迁移等,是当前研究的热点之一。本研究以膜片钳技术为基础,结合分子、细胞生物学技术,从H2O2对BKCa通道的作用,PTEN对H2O2诱导的BKCa通道激活的作用和PTEN磷脂酶活性对H2O2诱导的BKCa通道激活的调节等三个方面阐释PTEN、BKCa通道和H2O2之间的相互关系,旨在阐明H2O2激活BKCa通道、舒张血管的分子机制,为进一步探索氧化诱发的心血管疾病机制提供基础。本文以鼠源BKCa通道α亚基（Slo）基因（mSlo）在HEK 293细胞表达,运用inside-out和cell-attached两种不同的膜片钳记录模式检测BKCa通道电流,研究H2O2对BKCa通道的作用。在inside-out模式下,发现以Oμmol Ca2+电极外液灌流时H2O2能明显抑制BKCa通道电流,且DTT对抑制的电流有部分恢复作用。而以10μmolCa2+电极外液灌流时,H2O2、DTT对BKCa通道电流均无明显作用。说明H2O2对BKCa通道的作用主要依靠氧化还原效应影响通道对Ca2+的敏感性。在cell-attached模式下,我们发现H2O2能显著、快速增强BKCa通道活性,表明H2O2刺激BKCa通道能产生两种完全不同的作用。而巯基特异性的氧化剂DTNB在两种模式下均抑制BKCa通道活性,说明在cell-attached模式下H2O2和DTNB对BKCa通道的作用机制不同。H2O2对BKCa通道的影响受作用方式和H2O2浓度的影响。为了研究PTEN在H2O2激活BKCa通道电流中的作用,我们构建了PTEN-Tdimer2的嵌合基因克隆表达质粒。通过将PTENwt与mSlo或mSlo和hβ1在HEK 293细胞共转染,在cell-attached模式下记录BKCa通道电流,发现在PTENwt过表达的细胞上,不管有无β1的表达,H2O2刺激初始10 min都不会明显增加BKCa通道的活性。此结果不仅说明PTEN能抑制H2O2诱导的BKCa通道激活,而且证实β1亚基的存在并不影响PTEN的作用。进一步以PI3K抑制剂LY294002或Wortmannin孵育细胞,在cell-attached模式下记录电流,发现H2O2刺激初始10 min也并不明显增强BKCa通道活性,说明PI3K参与了H2O2诱导的BKCa通道激活过程。为进一步阐明PI3K/PTEN通路对H2O2诱导BKCa通道激活的生理、病理学意义,我们观测了LY294002对H2O2诱导的血管舒张的作用,发现LY294002能明显抑制H2O2诱导的血管舒张,但当BKCa通道阻断剂Iberiotoxin存在时,LY294002的抑制作用消失,说明PI3K是通过BKCa通道的调节参与H2O2诱导的血管环舒张作用。为了进一步阐明PTEN对H2O2激活BKCa通道的抑制作用机制,将mSlo与磷脂酶活性缺失的PTENC124S或PTENG129E在细胞共表达,发现H2O2诱导的BKCa通道激活并没有被抑制,说明PTEN对H2O2诱导的BKCa通道激活的抑制作用主要是通过其磷脂酶活性实现的。针对PTEN蛋白的磷脂酶活性,我们应用Western Blot分析了H2O2刺激PTENwt、PTENC124S、PTENG129E过表达细胞产生的p-AKT表达变化,发现H2O2刺激初期并不影响PTEN对p-AKT表达的抑制作用,但是在刺激30 min后p-AKT的表达增加,可能与H2O2对PTEN的氧化有关。通过激光共聚焦扫描显微镜检测H2O2刺激PTENwt、PTENC124S、PTENG129E过表达细胞后胞内钙浓度变化,发现与对照组细胞相比,在PTENwt过表达细胞中H2O2引起胞内钙浓度增加明显降低,时间上显著延长,而在磷脂酶活性缺失的PTENC124S和PTENG129E过表达细胞中却没有明显变化。说明H2O2诱导的BKCa通道激活是受PTEN的磷脂酶活性调节,p-AKT、钙浓度的变化可能是作用于BKCa通道的重要途径。