【摘 要】
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目的:诱导Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽的淋巴细胞,探究MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的功能特点。方法:一、用Net MHCIIpan 4.0和SYFPEITHI两个预测T细胞表位的在线预测系统对小鼠Survivin抗原15个氨基酸的MHC-Ⅱ类表位进行筛选。将筛选出的MHC-Ⅱ类表位肽进行合成,制成肽疫苗,免疫C57BL/6野生型小鼠,分离
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目的:诱导Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽的淋巴细胞,探究MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的功能特点。方法:一、用Net MHCIIpan 4.0和SYFPEITHI两个预测T细胞表位的在线预测系统对小鼠Survivin抗原15个氨基酸的MHC-Ⅱ类表位进行筛选。将筛选出的MHC-Ⅱ类表位肽进行合成,制成肽疫苗,免疫C57BL/6野生型小鼠,分离其脾脏淋巴细胞。诱导Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽的淋巴细胞,利用流式和钙黄绿素检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞对小鼠黑色素瘤B16F10细胞的作用。利用Western Blot检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞与B16F10细胞共培养后颗粒酶B和穿孔素的表达情况。利用ELISA检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞中IFN-γ和IL-10的分泌情况。二、设计了针对小鼠Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位基因的表位盒。利用基因工程的方法分别构建含有Survivin抗原的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位的小鼠Survivin抗原表位基因疫苗。三、用B16F10黑色素瘤细胞对小鼠进行荷瘤,建立荷瘤小鼠模型。在不同的时间点,将带有Survivin抗原的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位的基因疫苗用脂质体包裹,通过尾静脉注射到小鼠体内。观察肿瘤生长变化,测量肿瘤体积大小和重量,通过HE染色和IHC的方法检测肿瘤局部淋巴细胞的浸润情况,QPCR法检测肿瘤局部浸润CD8+T细胞的耗竭程度。结果:在体外细胞学实验中,Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞对小鼠黑色素瘤B16F10细胞系具有一定的杀伤作用,与对照组相比,颗粒酶B和穿孔素的表达也有所增加。当Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞共同作用时,杀伤效果更佳。MHC-Ⅱ类表位肽诱导组中IFN-γ表达量高而IL-10表达量低,说明Survivin抗原MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞主要是Th1类细胞。体内动物实验中,Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ表位基因疫苗能够有效抑制肿瘤的生长。与早期治疗和晚期治疗组相比,肿瘤疫苗预防组的肿瘤生长大大减缓,治疗效果更显著。无论进行早期还是晚期治疗,肿瘤生长均能得到有效控制。HE染色和IHC的结果显示,实验组中肿瘤局部坏死细胞更多,淋巴细胞的浸润也更多。在MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ表位基因疫苗共同作用时,肿瘤局部浸润的CD8+T细胞表面抑制性受体PD-1,Tim-3,2B4的表达有所下降,说明MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类抗原表位联合作用时可能降低了肿瘤局部浸润T细胞的耗竭程度。结论:小鼠Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ表位肽诱导的T淋巴细胞在体外对B16F10细胞具有一定的杀伤功能。基于小鼠Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ表位的基因疫苗可以激活抗原特异性T细胞的应答,从而发挥抗肿瘤作用,有效控制小鼠肿瘤的生长。
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