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异位骨化症（heterotopic ossification,HO）是指发生于肌肉或结缔组织中的非典型骨形成现象,常见于骨折、烧伤以及颅脑外伤等之后。由于HO形成直接影响关节活动度,压迫周围神经和皮肤导致神经痛以及皮肤溃疡,严重影响患者康复治疗,甚至导致残疾,给家庭和社会带来沉重的负担。因此如何预防和逆转HO的病理过程,具有重大的经济和社会价值。目前对于HO的形成机制以及治疗策略尚不十分清楚,现有的研究结果证明,内皮细胞向间质细胞转化（EndMT）在异位骨化（HO）病程中起主要作用。血管内皮细胞在炎症因子和局部神经-内分泌系统调控下突破血管屏障游离至组织当中,并去分化为间质干细胞,在局部条件下进而分化为软骨细胞和骨细胞,通过软骨化成骨过程形成HO组织。分子生物学研究已证明,TGF-β（转化生长因子-β）超家族信号传导途径是EndMT的主要信号通路,而SMAD7是TGF-β信号通路重要的抑制性基因。基于SMAD7基因在阻止肌成纤维细胞转化等EndMT进展中的潜能,我们验证其是否是HO潜在的治疗靶点。第一部分SMAD7慢病毒载体（Lv-SMAD7-GFP）的构建与有效性评估在本部分研究中,我们首先计划构建了用于能够持续稳定表达SMAD-7基因的慢病毒载体,并测试其相关性能。载体构建基于pCDH1-MCS1-EF1-copGFP（CD511A-1）,SMAD7被插入到EcoRI和BamHI位点之间。瞬时转染pCDH1-MCS1-EF1-copGFP（PLV-对照）和pCDH1-SMAD7-EF1-copGFP（pLv-SMAD7）到293TN细胞后,两组GPF表达率均达约90%,提示SMAD7被正确插入到载体中。随后采用定量PCR（qPCR）和蛋白印迹测试检测转染后即刻SMAD7的表达水平,其结果显示,相对于pLv-对照组,转染pLv-SMAD7的细胞中SMAD7的表达强度明显增高,其结果具有显著性（qPCR,4.8倍,p<0.0001;蛋白印迹,3.5倍,光密度法）。最后,我们采用293TN细胞转染慢病毒和SMAD7重组质粒,荧光倒置显微镜下观察显示充分转染,裂解293TN细胞,并收集慢病毒,测定慢病毒滴度为1.5×104ifu/μl（终点稀释法）。调整病毒颗粒浓度至1×104ifu/μl进行分装,-80℃保存第二部分和第三部分实验使用。第二部分转染SMAD7慢病毒载体与大鼠血管内皮细胞的体外共培养研究本部分研究首先采用活细胞荧光计数法确定Lv-SMAD7-GFP对大鼠主动脉内皮细胞（RAOECs）的最佳感染复数（MOI）为10。并以此作为细胞转染强度。在确定Lv-SMAD7-GFP对RAOECs的转导效率后,细胞经Lv-control-GFP和Lv-SMAD7-GFP转导后,于首次传代（P1）及感染后48、72、及96h收集细胞并用Real-Time PCR和Western blot检测mRNA及蛋白含量;其结果显示SMAD7的表达随时间持续增加,于96h达到高峰,且在P1传代时保持稳定,以上结果证实经病毒转导后SMAD7基因在RAOECs内能够持续稳定的表达,。为了模拟细胞水平上TGF-β1对局部EndMT的影响,我们使用10ng/m L的TGF-β1刺激RAOECs 48h以确定SMAD7高表达对RAOECs细胞表型的影响。理论上,单纯TGF-β1刺激RAOECs后会下调内皮细胞标志物CD31和VE-cadherin表达,并上调间质标志物N-cadherin和vimentin表达。实验结果显示,相比对照组,Lv-SMAD7-GFP转染后会上调CD31和VE-cadherin的表达,其幅度几乎可以抵消TGF-β1处理造成的下调。同时,SMAD7过表达也还下调了N-cadherin和vimentin的表达。以上结果证实在细胞水平上,Lv-SMAD7-GFP转导RAOECs后SMAD7基因高表达能够有效逆转TGF-β1介导的RAOECs的EndMT途径。第三部分转染SMAD7慢病毒载体局部注射大鼠跟腱损伤后异位骨化模型的实验研究本部分研究首先成功的制作了大鼠跟腱切断HO动物实验模型,影像学和组织学检测都提示术后大鼠跟腱局部出现了典型的HO组织,具有明显的EndMT表现。我们在该动物模型中局部注射载SMAD7慢病毒颗粒后,采用real-Time PCR和Western blot分析检测发现,相对于对照侧,跟腱组织中SMAD7持续性高表达,VE-cadherin和CD31上调,而N-cadherin和vimentin下调,第6和第10周,变化尤其明显。这些数据与体外RAOEC实验中的结果一致。采用组织学和影像学检测结果显示,Lv-control-GFP颗粒局部注射大鼠跟腱切断HO动物实验模型中,跟腱组织HO程度和范围明显的减轻,EndMT表现被明显抑制。提示大鼠跟腱切断HO模型中,Lv-control-GFP颗粒局部注射能够有效逆转EndMT途径介导的HO。