论文部分内容阅读
肾癌(renal cell carcinoma,RCC),是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,其发病率约占所有恶性肿瘤的4%,死亡率为2.4%。肾癌对传统肿瘤治疗手段如放疗和化疗等不敏感,临床上主要通过手术治疗,但对于复发或转移的患者效果较差,约30%的患者诊断时已经发生转移,预后极差。肾透明细胞癌(clearcell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾癌最常见的病理类型,也是肾癌中侵袭、转移等恶性程度极高的肿瘤类型。然而,肾癌发生发展的分子机制尚不清楚。因此,阐明其中的分子机制,鉴定和开发新的分子治疗靶标及给药策略是肾癌诊治研究亟待解决的关键问题。SPOP(speckle-type POZ protein)是一种包含 BTB/POZ 结构域的 E3 泛素连接酶组分蛋白。最近的研究成果显示,SPOP是促进肾癌发生发展的重要分子,也是肾癌分子治疗极具价值的潜在靶点。然而,SPOP在肾癌发生发展中的作用和调控机制尚未完全明了,深入探索SPOP表达调控网络及其生物学功能对于阐明肾癌发生发展的分子机制及制定新型的诊治策略显得尤为重要。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)的发现将人类对基因表达调控网络的认识提高到了一个新的水平。miRNA是一类内源性单链小分子非编码RNA,长度为19-22nt,它能通过其种子序列特异性地结合在靶信使RNA(mRNA)的3’端非翻译区(3’UTR),导致mRNA降解或者翻译抑制,从而在转录后水平调控基因的表达。本课题组前期研究发现,一些miRNA在肾癌组织中表达水平发生特异性改变,它们通过调控关键蛋白的表达参与肾癌的发生发展。然而,是否有miRNA通过靶向调控原癌基因SPOP参与肾癌的发生发展尚不清楚。因此,本课题的目的是探寻调控SPOP的miRNA,明确miRNA-SPOP调控轴在肾癌发生发展中的作用和分子机制。本论文中,我们首先采用免疫组化和Western Blot实验对120例临床标本研究证实SPOP在肾透明细胞癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.001),并且与患者预后不良密切相关(P=0.001)。进一步用siRNA敲降人肾癌细胞株A498和ACHN中SPOP的表达,通过CCK8细胞增殖实验、EdU增殖实验、侵袭实验和细胞划痕实验等细胞功能实验证实SPOP能有效促进肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移,确认SPOP在肾癌中起关键的原癌基因作用。随后,我们运用多种生物信息学方法预测出1 0个可能与SPOP 3’UTR结合调控SPOP表达的候选miRNA,经qRT-PCR检测发现,5个miRNA在肾透明细胞癌组织中表达下调,其中miR-520c-3p、miR-372-3p和miR-373-3p同属一个家族,下调最为明显,且与SPOP蛋白水平呈显著负相关性。之后,我们运用荧光素酶报告实验和Western Blot实验证明miR-520/372/373家族在转录后水平抑制SPOP蛋白的表达,并回复SPOP下游蛋白PTEN和DUSP7的水平,是调控SPOP的关键miRNA。接下来,我们用miRNA mimics和慢病毒分别实现miR-520c-3p、miR-372-3p和miR-373-3p在A498、ACHN中的瞬时转染和稳定转染,再采用上述细胞进行细胞功能实验观察到miR-520/372/373家族可通过抑制SPOP有效阻抑肾癌细胞增殖、侵袭和转移。进一步利用多种小鼠荷瘤模型包括裸鼠皮下植瘤模型、裸鼠原位植瘤模型及原位瘤转移模型等体内实验,发现miR-520/372/373家族能显著抑制肾癌的生长、侵袭及肺转移,并有效回复SPOP对肾癌生长、侵袭及肺转移的促进作用,提示miR-520/372/373家族通过调控SPOP蛋白的表达抑制肾癌的发生发展,具有治疗肾癌的潜能。此外,为探究miR-520/372/373家族在肾癌组织中表达下调的原因,我们运用生物信息学方法预测调控miR-520/372/373家族表达的转录因子,结合qRT-PCR、染色质免疫共沉淀实验、荧光素酶报告实验和Western Blot等实验发现转录因子E2F1结合在miR-520c和miR-372/373基因启动子区域中特定位点抑制其表达,并间接调控其下游SPOP信号通路。同时,临床样本研究观察到E2F1蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达显著上调,且与miR-520/372/373家族呈显著负相关关系。结果提示,E2F1是调控miR-520/372/373家族的转录因子,在肾癌中miR-520/372/373家族的下调是由于E2F1上调所致。综上,本课题通过临床样本研究、体外细胞实验和多种小鼠荷瘤模型体内实验明确miR-520/372/373家族通过转录后水平调控关键的原癌基因SPOP及其下游通路,有效抑制肾癌的发生发展,是抑癌基因;证明E2F1-520/372/373家族-SPOP调控轴在肾癌的发生发展中起重要作用。本研究结果为阐明肾癌发生发展机制提供了新思路,也为肾癌治疗提供了新靶标和新策略。