论文部分内容阅读
目的:1.构建糖尿病孕鼠致神经管畸形（neural tube defects,NTDs）鼠胚模型并检测孕鼠血清及胚胎脑组织β-羟丁酸（β-hydroxybutyrate,BHB）含量。2.研究BHB是否可以诱导NTDs。3.研究BHB是否通过抑制HDAC1、HDAC3的表达,增加H3K27ac水平,随后引起MEST表达水平增加,干扰LRP6的成熟引起NTDs。方法:1.通过腹腔注射链脲佐菌素构建母体糖尿病致NTDs模型,运用体视显微镜进行胚胎形态学观察,运用HE染色的方法观察E10.5胚胎神经管的闭合状态。2.通过Elisa检测正常孕鼠和糖尿病孕鼠血清、正常孕鼠胚胎和糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织匀浆液中BHB含量。3.通过体外全胚胎培养及检测BHB对NTDs的影响,,通过ELisa检测血清BHB对胚胎脑组织BHB含量的影响。4.通过Western blotting、免疫组化检测正常孕鼠胚胎和糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织中HDAC1、HDAC3、H3K27ac的表达水平。5.通过Real-time PCR、Western blotting及免疫荧光法检测不同浓度BHB处理HT-22细胞后HDAC1、HDAC3及H3K27ac表达变化。6通过Real-time PCR法检测正常孕鼠胚胎和糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织中Mest的转录水平。7.通过Western blotting法检测正常孕鼠胚胎和糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织中MEST、成熟LRP6蛋白质的表达水平。8.通过Western blotting法检测BHB处理的HT-22细胞MEST及成熟LRP6的蛋白质表达变化。9.通过Western blotting法检测BHB处理的HT-22细胞回补HDAC1、HDAC3后,H3K27ac、MEST及成熟LRP6的蛋白质表达变化。10.统计学分析方法:通过SPSS16.0软件分析数据,用均数±标准差（X±S）表示,P<0.05代表有统计学意义。结果:1.以200 mg/kg的剂量将链脲佐菌素腹腔注射到E5.5ICR孕鼠体内,孕鼠在E8.5-E10.5血糖值均高于16.7mM,胚胎NTDs率增加至17.2%,NTDs胚胎呈明显的露脑畸形或脊柱裂;HE染色显示NTDs胚胎神经管未闭合。2.糖尿病孕鼠血清中BHB含量显著高于正常孕鼠（E8.5:P<0.05;E9.5:P<0.001;E10.5:P<0.001）。糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织匀浆液中BHB含量显著高于正常孕鼠胚胎（P<0.001）。3.正常血清培养E8.5胚胎2天后,生长状态良好。含2mM BHB的血清培养E8.5胚胎2天后,胚胎生长发育迟缓。含4mM BHB的血清培养E8.5胚胎2天后,胚胎生长发育迟缓且可见NTDs。Elisa结果显示随着血清中BHB浓度的增加,胚胎脑组织BHB含量也增加。4.Real-time PCR结果显示:糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织较正常孕鼠胚胎脑组织中Hdac1、Hdac3 m RNA表达水平下降（Hdac1:P<0.05;Hdac3:P<0.05）。Western blotting结果显示:糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织较正常孕鼠胚胎脑组织中HDAC1、HDAC3蛋白质表达水平下降（HDAC1:P<0.01;HDAC3:P<0.01）。Western blotting及免疫组化结果显示糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织较正常孕鼠胚胎脑组织H3K27ac水平增加（P<0.05）。5.Real-time PCR结果得出:用含2mM和4mM BHB培养基培养的HT-22细胞较正常细胞Hdac1（2mM:P<0.001;4mM:P<0.001）、Hdac3（2mM:P<0.05;4mM:P<0.01）表达均显著降低,表明BHB降低了Hdac1、Hdac3的表达。Western blotting和细胞免疫荧光结果均显示:含4mM BHB培养基培养的细胞较正常细胞H3K27ac水平显著增加（P<0.001）。6.Real-time PCR结果得出:糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织较正常孕鼠胚胎脑组织中Mest mRNA表达水平增加（P<0.05）。7.Western blotting结果显示:糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织较正常孕鼠胚胎脑组织中MEST蛋白质表达水平增加、成熟的LRP6白质表达水平下降（MEST:P<0.05;成熟的LRP6:P<0.05）。8.BHB处理HT-22细胞后,MEST蛋白质表达水平增加（P<0.01）,成熟LRP6的蛋白质表达水平下降（P<0.01）。9.BHB处理的HT-22细胞回补HDAC1、HDAC3后H3K27ac水平降低（HDAC1:P<0.05;HDAC3:P<0.05）、MEST表达降低（HDAC1:P<0.05;HDAC3:P<0.01）及成熟LRP6的蛋白质表达水平上升（HDAC1:P<0.01;HDAC3:P<0.01）。结论:1.腹腔注射200mg/Kg链脲佐菌素导致的糖尿病孕鼠可引起ICR胎鼠NTDs,糖尿病孕鼠血清BHB含量升高,糖尿病孕鼠致NTDs胚胎脑组织较正常孕鼠胚胎脑组织BHB含量高,与血清中BHB变化正相关。2.增加体外全胚胎培养血清中的BHB含量可导致胚胎NTDS,且血清中高浓度的BHB可引起胚胎脑组织BHB含量增加。3.实验表明糖尿病孕鼠可能通过增加胚胎脑组织BHB含量抑制HDAC1、HDAC3的表达,增加H3K27ac水平,随后引起MEST表达水平增加,干扰LRP6的成熟引起NTDS。