论文部分内容阅读
铜绿假单胞菌能引起林麝的化脓病,该病病程缓慢、不易发现,发现后也难以治愈,给人工养殖林麝造成巨大损失。本试验旨在建立一种特异性强、重复性好、灵敏度高的间接ELISA方法,为监测林麝体内的铜绿假单胞菌抗体水平,并为防控铜绿假单胞菌引起的林麝化脓性疾病提供帮助和指导。提取铜绿假单胞菌Sp-1株的外膜蛋白作为包被抗原。经SDS-PAGE分析,提取的外膜蛋白有7-10条带,分子量在15kDa～100kDa之间,是该菌的主要外膜蛋白。通过Western Blotting检测,发现该外膜蛋白有4条印迹条带,分子量分别是46 kDa、34kDa、25 kDa和19 kDa,可用作包被抗原。本试验建立的间接ELISA方法的最佳条件：外膜蛋白包被浓度为1.5 μg/ml;包被条件是37℃,温箱孵育4h；封闭条件为5%脱脂奶粉37℃作用2h；抗体稀释倍数为1000倍,抗体与抗原作用条件为37℃孵育1.5 h；HRP-SPA稀释倍数为64000倍,与抗体作用条件为37℃孵育1.5 h; TMB作用条件为37℃显色15 min。用建立的间接ELISA方法检测了大肠杆菌抗血清、沙门氏菌抗血清、不动杆菌抗血清和金黄色葡萄球菌抗血清,结果这四种菌的抗血清均判为铜绿假单胞菌抗体阴性；把Sp-1株阳性血清用外膜蛋白处理后进行检测,结果表明,与未处理组相比,处理组OD值显著降低,阻断率在63.69%～75.38%之间。经板间重复试验和板内重复试验进行重复性检测,变异系数在2%～10%之间。将本试验制备的铜绿假单胞菌Sp-1株阳性血清倍比稀释后进行检测,当稀释至32000倍时,其P/N值>2,结果仍判为阳性。用该方法检测了30份经Sp-1株免疫后的小鼠血清,效价达到1：12500、1：2500、1：500和1：100的分别有13份、7份、2份和2份,低于1：100的有6份。同时,检测了2014年10月份和11月份采集的林麝血清样品32份,有4份血清判为阳性,其余判为阴性。本试验建立的检测林麝铜绿假单胞菌抗体的间接ELISA方法具有重复性好、特异性强和灵敏度高的优点,可用于林麝群体的抗体水平的监测,能够为制定合理的免疫程序提供理论依据和防控铜绿假单胞菌引起化脓性性疾病提供帮助和指导。