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目的:利用IVF治疗后的人废弃囊胚探究内细胞团分离方法对人胚胎干细胞建系的影响,并利用PAH基因突变携带者夫妻的PGD废弃囊胚建立人胚胎干细胞系,为后续相关研究提供细胞材料。方法:收集经IVF治疗后正常受精的废弃囊胚10枚和PGD来源的携带有PAH基因突变的废弃囊胚2枚,IVF来源的废胚A组(1#-5#)以及PGD来源的2号囊胚采用激光打孔联合机械牵拉法,IVF来源的废胚B组(6#-10#)以及PGD来源的4号囊胚采用全囊胚接种法,比较以上两种内细胞团方法形成原代克隆和传代的效率,并对已建立的胚胎干细胞系进行鉴定。结果:A组与B组的内细胞团贴壁情况无明显差异,均为80%(4/5),A组原代克隆的形成率为60%(3/5),明显高于B组原代克隆的形成率20%(1/5),最终可传代的原代克隆仅为A组中1#;PGD来源的4号囊胚形成原代克隆后由于滋养层细胞的过度生长导致传代后内细胞团增殖物停止扩增;PGD来源的2号囊胚成功建立胚胎干细胞,携带有父方的PAH基因突变位点。对干细胞进行鉴定发现碱性磷酸酶染色阳性,染色体核型为二倍体,表达干细胞标志物SSEA-3,SSEA-4和OCT-4,干细胞体内及体外分化实验证明具有向三胚层分化能力。结论:激光打孔联合机械牵拉的内细胞团分离方法可以提高人胚胎干细胞建系的成功率;成功建立PGD来源的含PAH基因突变的人胚胎干细胞。目的:利用CRISPR/Cas9技术对携带PAH致病突变的人受精卵进行基因修复,并统计其修复效率和安全性,为实现从根源上治疗苯丙酮尿症提供初步的研究基础。方法:首先在携带有PAH致病突变的人胚胎干细胞上验证设计的3种不同sg RNA的靶向效率,并挑选出效率最高的sg RNA行体外转录;将体外培养成熟的卵母细胞分为实验组与对照组,实验组将携带有PAH基因杂合突变患者的精子和sg RNA、Cas9蛋白与ss ODN的混合液共同注射入成熟卵母细胞,对照组仅注射携带PAH基因杂合突变患者的精子,分析CRISPR/Cas9注射对胚胎发育的影响,CRISPR/Cas9对人胚胎突变基因的修复效率,同源重组修复与非同源末端连接修复所占比例,脱靶效率以及可能带来的安全问题。结果:hs-PAH-ngg-sg在人胚胎干细胞中的靶向编辑效率最高;对照组CRISPR/Cas9注射后存活率、2PN受精率、卵裂率和卵裂期优质胚胎率均高于实验组,但差异均无统计学意义(P>0.05);实验组WT/WT的胚胎比例为80%,明显高于对照组的45%,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组针对MUT/WT的靶向编辑效率为100%,其中经外源单链DNA模板的同源重组的效率仅为25%(且是不完整的重组),相对应的WT等位基因的脱靶率为5.56%,其他可能发生脱靶的位点分析未见脱靶情况。结论:利用CRISPR/Cas9技术对携带PAH致病突变的人受精卵进行基因靶向的效率为100%,其中经外源单链DNA模板部分同源重组修复的效率为25%。实验组中靶向等位基因为双野生型基因型的比例明显提高,对野生型等位基因的脱靶率为5.56%,仍存在通过非同源末端连接方式的修复现象,导致插入或缺失突变,人胚胎基因编辑的临床可行性与安全性仍需进一步研究。