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目的:在益气除痰方(YQCTF)前期研究基础上,通过体内外双水平实验进一步探讨YQCTF对肿瘤微环境血管新生作用的分子机制及GRP78参与血管新生信号通路调控作用,为其抗肿瘤血管新生治疗提供临床应用的理论基础。方法:体外细胞实验部分:广州中医药大学肿瘤中心治疗抗肿瘤经验方YQCTF作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。(1)运用CoCl2化学诱导缺氧模拟细胞肿瘤缺氧微环境,采用CCK8法确定CoCl2诱导细胞缺氧模型条件以及评估不同浓度YQCTF干预缺氧微环境下HUVEC活性的影响;(2)通过CCK8法确定YQCTF干预浓度,显微镜观察细胞形态学。利用流式细胞术通过AnnexinV/PI染色法检测细胞凋亡,通过细胞DNA含量测定检测细胞周期,观察YQCTF对HUVEC细胞凋亡和增殖的影响;(3)采用Tube Formation实验观察YQCTF对缺氧HUVEC血管形成的影响;(4)利用Transwell实验、划痕实验观察YQCTF对细胞迁移侵袭能力和修复能力的影响。(5)采用QPCR和Western Blot法检测YQCTF对缺氧HUVEC中血管新生相关通路HIF-1 α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAKmRN水平和蛋白表达及其磷酸化的水平研究YQCTF对血管新生的调控作用。(6)通过siRNA干扰技术沉默GRP78探讨GRP78参与调控血管新生的机制研究.(7)通过免疫荧光观察在缺氧、YQCTF干预及沉默GRP78条件下HUVEC中的GRP78表达情况,探讨YQCTF参与调控缺氧微环境细胞血管新生的分子机制。体外动物实验部分:选用SPF级BALB/c雄性裸鼠,构建肺腺癌A549细胞移植瘤裸鼠模型,造移植模型成功后随机分为两组:Control组和YQCTF组。YQCTF组给予每日YQCTF水煎液灌胃,Control组给予等体积生理盐水灌胃。连续给药3周,期间定期观察移植瘤裸鼠生长状态,每3d测量裸鼠体重、瘤体体积,移植瘤裸鼠于给药21d后处死,剥离移植瘤瘤体称量瘤重、计算抑瘤率,并观察肺、肝转移情况,评估YQCTF对肺癌肿瘤生长、转移的影响;采用免疫组化法(IHC)检测移植瘤组织微血管密度及血管新生相关信号通络HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK表达及其磷酸化水平。评价YQCTF对肿瘤血管新生的影响。结果:体外细胞实验部分:(1)CCK8法检测结果显示,缺氧化学诱导剂CoCl2随着时间延长、浓度增高,抑制细胞活力,产生细胞毒性,选择对细胞无明显抑制活力和增殖的浓度进行后续实验(100μM,48h)。当100μM的CoCl2干预48h后,细胞管腔形成、迁移及侵袭能力增强(P<0.05,P<0.01);(2)CCK8检测结果提示提示YQCTF能明显抑制缺氧HUVEC的细胞活力(P<0.05,P<0.01),并与药物浓度呈依赖性,并随着YQCTF浓度升高,HUVEC活力下降;(3)通过倒置显微镜观察HUVEC细胞形态变化,结果显示YQCTF可抑制缺氧HUVEC增殖;(4)流式细胞仪检测AnnexinV/PI染色结果提示YQCTF呈剂量依赖性诱导细胞凋亡(P<0.05,P<0.01),测定细胞DNA含量结果显示YQCTF可显著增加G0/G1期细胞的比例,降低S和G2/M比例(P<0.05,P<0.01),抑制细胞分裂增殖;(5)Tube Formation实验结果显示YQCTF可显著抑制细胞血管形成(P<0.05,P<0.01)。(6)细胞划痕结果表明YQCTF干预可明显抑制细胞修复能力(P<0.05,P<0.01)。(7)Transwell实验提示YQCT显著降低缺氧HUVEC细胞迁移及细胞侵袭力,可抑制细胞转移,与药物浓度呈依赖性(P<0.05,P<0.01);(8)Western blot和QPCR结果显示,缺氧微环境可显著上调血管新生相关通路信号分子 HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK 蛋白和 mRNA 表达水平,并能增强AKT、ERK1/2、FAK磷酸化水平(P<0.05,P<0.01)。YQCTF干预后,能显著下调细胞的 HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK 蛋白和 mRNA 表达水平,抑制AKT、ERK1/2、FAK活性,与YQCTF浓度呈依赖性降低(P<0.05,P<0.01),提示YQCTF可改善缺氧微环境,抑制缺氧HUVEC血管生成,其作用机理可能是通过调控上述多条信号通路表达。(9)免疫荧光结果显示,缺氧微环境下HUVEC的GRP78表达升高。YQCTF干预后细胞内和细胞膜的GRP78荧光强度均降低;(10)siRNA转染HUVEC沉默GRP78表达,结果显示转染siRNAGRP78后,HUVEC管腔形成、迁移和侵袭能力明显降低(P<0.01);沉默GRP78后,血管新生相关通路蛋白HIF-1α、VEGF/VEGFR 表达显著下调,抑制 AKT、ERK1/2、FAK 激活(P<0.05,P<0.01),提示GRP78参与血管新生进程,干预缺氧微环境,介导血管新生信号通路调控,对肿瘤生长转移发挥重要作用。(11)免疫荧光结果显示,沉默GRP78后,胞内和胞膜的GRP78荧光强度都明显降低,提示GRP78可能是血管新生中重要的靶信号分子。体内动物实验部分:(1)两组肺癌A549细胞移植瘤裸鼠模型的体重显示在实验周期内无明显差异,YQCTF对裸鼠体重的生长无显著抑制,YQCTF可抑制移植瘤瘤体体积(P<0.05,P<0.01),抑制瘤体肿重量(P<0.01),显示YQCTF对肺癌细胞移植瘤的生长有抑制作用。(2)免疫组化结果显示,YQFTF组的移植瘤组织微血管密度明显降低(P<0.01),提示YQCTF可抑制体内肿瘤细胞血管新生。YQCTF组与Control组相比,可明显抑制体内移植瘤细胞中HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK 表达及 AKT、ERK1/2、FAK 磷酸化水平(P<0.05,P<0.01),提示 YQCTF对抑制体内肿瘤血管新生的J机制与调控HIF-Iα、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK1/2、FAK信号通路表达相关。与体内细胞实验结果相符。结论:1.成功建立缺氧内皮细胞模型和裸鼠肺腺癌细胞移植瘤动物模型。2.体外HUVEC在缺氧条件下血管新生能力增强,YQCTF可通过改缺氧微环境,抑制HUVEC增殖、管腔形成、细胞迁移和侵袭能力,降低HUVEC血管新生。体内YQCTF能显著降低移植瘤微血管密度,抑制血管生成,抑制肺癌细胞生长增殖。3.YQCTF抗肿瘤血管新生机制可通过多途径、多靶点抑制HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK1/2、FAK信号通路表达。4.GRP78参与血管新生信号通路调控。缺氧微环境可诱导GRP78表达升高,GRP78可能通过调控HIF-1 α、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK信号通路参与肿瘤血管形成。