论文部分内容阅读
Br140又名Brpfl(Bromodomain and PHD finger containing 1)、Peregrin,是一种新发现的trxG(trithorax group)家族成员之一，关于其的功能研究目前正处于起步阶段。研究表明其通过组蛋白的修饰，参与到细胞核内Hox基因的转录调控，从而在神经系统的生长发育、脊椎动物的发育过程和体节的分化以及肿瘤的发生发展过程中扮演着十分重要的角色。因此，对于其在基因转录调控中的具体分子机制研究是当前发育生物学研究的一个热点。 为了探索Br140发挥基因转录调控的具体分子机制，本实验室使用黑腹果蝇为模式生物，研究黑腹果蝇中Br140（flybase ID:CG1845）基因的具体功能。 以下是本论文的主要结果: 1.果蝇Br140基因在果蝇组织中广泛表达，在果蝇发育的成虫阶段有该基因较高的表达水平，同时，Br140蛋白在进化过程中高度保守。Br140可以拮抗Polycomb对Hox家族基因的转录抑制作用，可能发挥着一个转录激活因子的作用。 通过蛋白序列比对分析，我们发现Br140基因编码蛋白在进化过程中高度保守。从flybase以及果蝇胚胎中原位杂交的实验表明，Br140基因在果蝇许多组织均有表达。RT-realtime PCR显示在果蝇个体发育的各个阶段均可发现Br140基因的表达，尤其在果蝇的成虫阶段有该基因的较高表达水平。在果蝇Kc167细胞系中也检测到该基因的表达。 本实验室前期研究表明，Polycomb对其靶基因caudal(cad)和pannier(pnr)具有转录阻遏作用，对Polycomb进行RNAi可以使nr和cad的转录显著地去阻遏。我们将Br140突变体果蝇与Polycomb突变体果蝇杂交后发现Br140基因的突变能减弱Polycomb突变所产生的同源异型转换表型。使用VDRC果蝇在果蝇中进行Br140RNAi实验，我们发现果蝇Br140基因拮抗Polycomb基因对Hox家族靶基因的转录阻遏。在此基础上，我们在Kc167细胞中对Br140和Polycomb同时进行了dsRNARNAi实验，结果表明，只干扰Br140时，pnr和cad的转录水平与对照组（Ctrl）基本相同，都受到阻遏;只干扰Polycomb时，pnr和cad的转录会显著地去阻遏;而当我们同时干扰Br140和Polycomb时，pnr和cad的转录又受到了阻遏。以上结果表明，Br140可能拮抗Polycomb对Hox家族靶基因的转录抑制作用。 2.构建了重组的表达质粒，在果蝇Kc167细胞系中过表达全长Br140CDS区。同时，构建了含EGFP报告基因的果蝇转基因质粒，注射果蝇胚胎后获得了过表达Br140的转基因果蝇，并实现了Br140基因的过表达。制备了抗果蝇Br140蛋白的鼠源多克隆抗体，并检测了该抗体识别果蝇中Br140蛋白的特异性。 我们使用果蝇Kc167细胞系表达载体pAc/V5.1-HisA构建了以Flag为标签的重组质粒Ac/V5.1-FlagBr140-HisA，测序正确后将重组质粒转染果蝇Kc167细胞系，Western blot方法检测到Flag标签，表明Br140基因已表达。同时，使用含有EGFP报告基因的attB-pUAST定点整合质粒，构建了attB-pUAST-FlagBr140-EGFP重组质粒，注射重组质粒到果蝇胚胎后成功制备了过表达Br140的转基因果蝇，并实现了果蝇中Br140基因的过表达。 我们使用原核细胞蛋白表达系统分别表达了Br140N端及C端的多肽序列，作为抗原用于免疫BALB/c小鼠，从免疫小鼠血清中获得抗果蝇Br140蛋白的鼠源多克隆抗体。将产生抗体效价较高的小鼠取脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合，制备杂交瘤细胞，经HAT筛选培养基培养后，获得杂交瘤细胞，并从杂交瘤细胞培养液中检测了抗果蝇Br140蛋白的抗体的效价。 综上所述，本研究工作初步探讨了Br140基因对果蝇生长发育的作用，以及Br140在PcG/trxG信号通路参与Hox家族基因表达调控的作用机制。我们的工作为深入研究Br140基因的功能提供了良好的工具，为进一步认识PcG/trxG信号通路在生物发育过程中的调控作用奠定了基础。