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第一部分环境污染物对斑马鱼胚胎TMBIM基因家族的表达的影响目的:研究环境污染物对斑马鱼胚胎TMBIM基因家族表达的影响,验证TMBIM基因家族是否与环境污染物铅,镉,甲醛交互作用共同影响斑马鱼胚胎的发育。方法:用铅、甲醛、镉三种常见的致畸的环境污染物暴露斑马鱼胚胎,利用RT-PCR技术检测TMBIM基因家族的表达情况。研究哪种环境污染物诱导TMBIM基因家族的表达上调。为了进一步验证TMBIM基因家族参与了环境污染物对于胚胎发育的作用过程。利用Morpholino技术敲降tmbim4基因,并用不引起明显发育异常的污染物浓度暴露已敲降tmbim4基因的斑马鱼胚胎,探讨tmbim4基因是否与环境污染物交互影响胚胎发育。结果:铅,镉对于斑马鱼胚胎的tmbim基因家族的表达无明显影响。甲醛使tmbim1,tmbim3及tmbim4的表达明显上调,其他tmbim基因的表达无明显变化。其中,tmbim4基因的上调表达最明显。敲降tmbim4基因使得甲醛暴露的斑马鱼胚胎凋亡明显增加,且这些凋亡增加的胚胎最终都死亡。结论:甲醛能够使tmbim1,tmbim3及tmbim4的表达上调,这三个基因参与了甲醛诱导的胚胎发育异常。tmbim4基因可与甲醛交互作用共同影响斑马鱼胚胎的早期发育。第二部分tmbim4基因敲除斑马鱼模型的建立目的:通过建立敲除TIBIM4基因的斑马鱼模型,为下一步的实验进行准备。方法:利用从中科院水生所获得的Cas9质粒及构建好的guide RNA质粒进行PCR,获得所需的目的片段,然后进行体外转录,回收产物,得到Cas9 mRNA及gRNA。将Cas9 mRNA及gRNA按一定比例混合(Cas9 mRNA 400ng/μL,gRNA 30ng/μL)。通过显微注射将其注射入单胞期斑马鱼受精卵。显微注射48小时后,收集10颗左右的斑马鱼卵,提取斑马鱼基因组DNA。进行PCR获取目的片段,利用T7E1酶切。凝胶电泳检验酶切片段。如与设计的靶序列相符,则证明酶切成功,靶位点有效。为进一步验证是否造成了移码突变。利用TA克隆测序验证。若TA克隆证明获得了移码突变,则将斑马鱼胚胎继续培养。2-3个月后,待斑马鱼性成熟后,与野生型斑马鱼杂交。将获得的F1代斑马鱼胚胎提基因组DNA,测序,看是否发生移码突变,若发生移码突变,则说明获得了敲除tmbim4基因的杂合子斑马鱼模型。结果:注射后斑马鱼胚胎提基因组DNA,酶切,凝胶电泳显示目的片段成功切开,TA克隆测序显示靶位点区缺失了一个bp的片段,成功获得了造成移码突变的斑马鱼胚胎。F1杂合子测序显示,靶位点区有7个bp的片段缺失,另有一条F0代斑马鱼的F1代后代有2个bp的片段缺失。说明F1代亦有移码突变,敲除tmbim4基因的斑马鱼模型成功建立。结论:CRISPR/Cas9技术是一项成熟的基因敲除技术,能成功造成斑马鱼基因组靶位点区的移码突变,从而获得敲除tmbim4基因的斑马鱼杂合子,成功建立敲除斑马鱼tmbim4基因的斑马鱼模型。