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研究目的:蛋白尿不仅是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的主要病理特征,而且也是促进CKD进展至终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的独立危险因素。蛋白尿既是肾小球损害的结果,更是继发性肾小管损伤的首要原因,在肾小球疾病向ESRD发展中起着举足轻重的作用。因此控制大量尿蛋白引起的肾小管损伤并进展至纤维化阶段是阻止或延缓CKD进展至ESRD关键治疗策略之一,具有重大意义。自噬是真核生物细胞内特有的一种高度保守的代谢过程,与细胞内环境的稳态密不可分,对多种生理和病理生理过程至关重要。在正常条件下,细胞本身存在一定的基础自噬,当受饥饿及缺血、毒性、免疫、氧化等病理条件刺激时,会进一步促进自噬的发生,自噬可以通过清除细胞内错误折叠的蛋白质对细胞起到保护作用。近年来多项研究表明自噬参与了肾脏疾病的进展。与此同时也有研究表明蛋白尿中的主要蛋白白蛋白可以激活肾小管上皮细胞的自噬水平,但其充当的角色如何仍然未能明确。总之本研究主要致力于探讨自噬在蛋白尿诱导的肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,Tif)中的作用,为逆转CKD向ESRD进展提供新的治疗策略及新靶点.研究方法:第一部分:通过回顾性总结盛京医院2015-06至2016-12经肾活检确诊为特发性膜性肾病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)患者30例作为实验组,所有患者均符合下述入选标准和排除标准。对照组为肾肿瘤患者肾脏切除手术标本中肾肿瘤组织旁1 cm以外的正常肾组织。通过透射电子显微镜检测IMN患者和正常肾组织肾小管上皮细胞(TECs)自噬体的数量,免疫组化检测自噬相关蛋白Beclin 1和LC3的表达,分析其与24 h尿蛋白定量(Upro)、肾间质纤维化程度(Tif)及肾功能等临床相关指标的相关性。第二部分:(1)研究对象为人近端肾小管上皮细胞(HK-2),用不同浓度的牛血清白蛋白BSA(0、1、5、10 mg/ml)处理HK-2细胞72 h后,用Western blot技术检测EMT相关指标即E-cadherin、α-SMA蛋白的表达;(2)用浓度为10 mg/ml BSA分别处理HK-2细胞0、24、48、72 h,用Western blot法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达;(3)用不同浓度的BSA(0、1、5、10 mg/ml)处理HK-2细胞72 h后,用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ与Beclin 1的表达;(4)在10 mg/ml BSA处理HK-2前1 h给予自噬抑制剂(3-MA终浓度为5 m M),后再给予BSA共处理72 h,分为4组:control(C组)、control+3-MA(C+3-MA组)、10 mg/ml BSA(BSA组)、10 mg/ml BSA+3-MA(BSA+3-MA组),用Western blot技术检测EMT相关指标即上皮标记物E-cadherin蛋白及间充质标记物α-SMA蛋白的表达,检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1的表达;(5)在10mg/ml BSA处理HK-2细胞前1 h给予自噬激动剂(Rapa终浓度为5μM),后再给予BSA共处理72 h,分为4组:control(C组)、control+Rapa(C+Rapa组)、10 mg/ml BSA(BSA组)、10 mg/ml BSA+Rapa(BSA+Rapa组),用Western blot技术检测上述E-cadherin、α-SMA、LC3Ⅱ及Beclin 1蛋白的表达。实验结果:第一部分:与正常肾组织相比,IMN患者组的TECs自噬体数量、自噬相关蛋白Beclin 1和LC 3表达显著增加;在IMN组中,与无纤维化(IMN-nf)组相比,有纤维化组(IMN-f)自噬小体数量、Beclin 1和LC 3表达均显著增加;在IMN患者中,自噬小体数量、Beclin 1和LC 3均与患者Tif累及面积成正相关;LC 3与24 h尿蛋白定量成负相关;Beclin 1与血清尿素氮(BUN)成正相关,自噬小体数量与患者性别具有一定的相关性。第二部分:(1)用不同浓度的BSA处理HK-2细胞72 h,发现BSA可以呈剂量依赖性诱导HK-2细胞发生EMT,即随着BSA浓度逐渐增加,其E-cadherin蛋白呈降低趋势,而α-SMA蛋白的表达则逐渐升高;(2)用同一浓度(10 mg/ml)BSA分别处理HK-2细胞0、24、48、72 h,发现BSA可以呈时间依赖性诱导HK-2细胞发生EMT,即BSA在同一浓度条件下,随着BSA诱导时间的逐渐增加,E-cadherin蛋白呈逐渐降低趋势,而α-SMA蛋白的表达则逐渐升高;(3)用不同浓度BSA处理HK-2细胞72 h,发现自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin 1的表达逐渐升高,即随着EMT的进展,自噬相关蛋白的表达逐渐升高;(4)给予3-MA后,发现与BSA组相比,BSA+3-MA组自噬相关蛋白LC3Ⅱ及Beclin 1的表达降低的同时,进一步促进了EMT即E-cadherin蛋白的表达进一步降低,而α-SMA蛋白的表达进一步升高;(5)给予Rapa后,发现与BSA组相比,BSA+Rapa组自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin 1的表达升高的同时逆转了HK-2细胞的EMT,即恢复了E-cadherin蛋白的表达,而进一步降低了α-SMA的表达。结论:1.IMN患者中,TECs自噬参与了Tif的进展。2.白蛋白可以呈剂量和时间依赖性诱导HK-2细胞的EMT。3.白蛋白可以呈浓度依赖性诱导HK-2细胞发生自噬即随着EMT的进展自噬被激活。4.激活自噬可以逆转白蛋白诱导的HK-2的EMT。