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龋齿、牙周炎及外伤等因素造成的牙齿缺失会大大降低人们的生活品质甚至影响全身健康。目前,临床上关于牙列缺损的措施主要是局部义齿修复或种植牙修复,这种修复方式具有良好的修复效果,但是一些不良后果也无可避免。牙齿再生是一种安全理想的牙齿缺失修复方法,目前对于牙齿再生的探索在组织工程牙方面已取得极大突破及进展,实现了牙根、牙髓等组织甚至全牙再生,而内源性牙齿再生尚处于早期探索阶段。目前对于牙内源性再生的研究由于没有合适的动物模型而受到限制。在本实验中,我们利用斑马鱼可活体成像及实时动态观察的优点进行了牙齿发育及再生的相关分子机制研究,主要探索了视黄酸信号通路在斑马鱼咽齿发育及再生过程中的作用,通过外源性视黄酸及其抑制剂对发育及再生过程中咽齿进行处理,初步探索了该信号通路的作用。另外,课题组成员前期构建的转基因鱼系Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)标记发育早期咽齿,经过探索,在本研究中我们成功构建了新的转基因鱼系Tg(scpp5:Dendra2-NTR),能终生特异性标记斑马鱼咽齿且特异性高,可以使斑马鱼咽齿的研究不受发育时间限制,利于更加深入探索牙齿发育机制。目的:探索视黄酸信号对斑马鱼咽齿发育及再生过程的作用。方法:(1)对处于不同发育时期的斑马鱼胚胎,分别用3×10~-7 M的全反式视黄酸(Retinoic Acid,RA)和1×10~-7 M的视黄酸抑制剂二乙氨基苯甲醛(exogenous 4-diethylaminobenzaldehyde,DEAB)处理,收集处理后不同时期的胚胎进行原位杂交检测相关基因、茜素红染色和共聚焦显微镜检测等方式,观察视黄酸信号在斑马鱼咽齿发育过程的作用;(2)视黄酸信号对牙齿再生过程的影响,是通过构建视黄酸降解酶及合成酶的过表达鱼hsp:cyp26b1-GFP和hsp:aldh1a2-GFP并分别与转基因系Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)杂交,再利用MTZ溶液处理,特异性损伤咽齿后对再生过程中的斑马鱼胚胎进行热激,在再生24 h和再生48 h时收集胚胎检测咽齿再生情况;(3)转基因鱼Tg(scpp5:Dendra2-NTR)的构建,我们从斑马鱼的基因库中克隆出基因scpp5一段长度为4.9 kb的启动子序列,并成功构建pBluescript2KS-scpp5-Dendra2-NTR重组质粒,纯化后的质粒通过显微注射到ABGO背景单细胞斑马鱼胚胎,经过连续三代正向遗传筛选出稳定遗传的转基因鱼系Tg(scpp5:Dendra2-NTR)。结果:(1)利用1×10~-7 M DEAB处理24-36 hpf斑马鱼胚胎后,在胚胎发育的48 hpf、56 hpf以及72 hpf检测咽齿发育情况,原位杂交结果显示斑马鱼咽齿特异性标记基因pitx2和fth1b表达消失,而在3×10~-7 M RA处理组,pitx2和fth1b的表达均较对照强;在5 dpf时收集胚胎做茜素红染色,结果显示在1×10~-7 M DEAB抑制组,无矿化牙齿形成,但在共聚焦显微镜下观察有未矿化牙胚存在,在3×10~-7 M RA组牙齿矿化略强于对照组,共聚焦显微镜下观察也可见较强的3V~1、4V~1和5V~1矿化,说明视黄酸信号在斑马鱼咽齿早期发育过程中发挥作用,抑制或增强视黄酸信号都将影响咽齿的正常发育。(2)对24-36 hpf斑马鱼胚胎用视黄酸抑制剂处理后,神经嵴细胞相关基因表达受到影响,其中标记上皮-间充质转化过程的基因snail1a表达略有下降,标记神经嵴细胞增殖和迁移的基因cad表达减少,表明视黄酸在咽齿发育早期主要通过影响神经嵴细胞的正常活动发挥作用,尤其神经嵴细胞的增殖与迁移。(3)利用转基因鱼Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)分别与hsp:cyp26b1-GFP和hsp:aldh1a2-GFP杂交,MTZ特异性损伤咽齿后热激恢复期胚胎,在恢复24小时和恢复48小时后,茜素红染色及共聚焦显微镜观察发现在Tg-hsp:cyp26b1-GFP组重生咽齿矿化较弱,在Tg-hsp:aldh1a2-GFP组中重生咽齿矿化强于对照组,同时重生咽齿的形状及数量并无差别,即在斑马鱼咽齿再生过程中,视黄酸信号在再生咽齿的矿化过程中发挥作用,而不影响再生咽齿的形状和数量。(4)原位杂交显示基因scpp5在3 dpf-13 dpf特异性表达于斑马鱼咽齿,在此基础上,本课题组成功构建Tg(scpp5:Dendra2-NTR)转基因鱼,3 dpf时可在咽齿部位观察到特异性绿色荧光,5 dpf时通过对Tg(scpp5:Dendra2-NTR)胚胎做抗体染色检测,发现基因scpp5融合绿色荧光蛋白Dendra2表达于斑马鱼咽齿周围,包绕斑马鱼咽齿,分泌钙相关蛋白促进咽齿的矿化。结论:视黄酸信号通路在斑马鱼咽齿早期发育过程中发挥重要作用,增强视黄酸信号可以咽齿矿化增强,抑制视黄酸信号则会导致发育障碍,且这种影响可能是通过调控神经嵴细胞的增殖和迁移来实现的;而在斑马鱼咽齿损伤再生过程中视黄酸信号仅轻微影响再生咽齿的矿化,表明视黄酸信号在斑马鱼咽齿发育及再生过程中发挥不同的功能,对早期咽齿发育更具意义。转基因鱼Tg(scpp5:Dendra2-NTR)优化了现有的Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)模型,可用于探索更晚期斑马鱼咽齿发育及再生的相关分子机制。