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海洋红树林内生真菌No.1403和No.1893是由香港城市大学Vrijmoed教授等分离的,中山大学林永成教授所带领的研究小组已分别从这两种菌中分离出多种蒽醌类抗生素和具有杀虫活性的物质,这些物质都具有很好的应用前景。本文主要以这两种真菌为研究对象,在生物学特性方面,对其进行了种属鉴定和生长条件优化;在生物防治应用方面,通过对峙培养,测定了这两种真菌对水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、香蕉炭疽盘长孢菌(Gloeosporium musarium)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f sp.cubense)等4种植物病原菌的抑制作用,对具有较好应用前景的真菌No.1403,还进行了香蕉枯萎病菌的田间防治试验。在次生代谢产物方面,除对主要成分的分析鉴定外,还对这两种真菌进行了抑制4种真菌和5种细菌的活性试验以及对斜纹夜蛾三龄幼虫的毒力试验。主要研究结果如下:
1、本文以传统真菌形态学鉴定为依据,结合分子生物学方法,分别鉴定了这两株真菌,通过比对18s rDNA、28s rDNA、Internal transcribed spacer(ITS)和Elongation factor-1[alpha](EF-1[alpha])四个基因序列片段,No.1893和No.1403最终分别被定为菜豆间座壳大豆变种(Diaporthe phaseolorum var sojae)和层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。在生长条件方面,利用统计分析软件SAS9.1.3和Statistica7.0,以菌丝产量为响应指标,对两种真菌的培养基配方、发酵时间和生长温度等培养条件进行了优化。
2、通过研究No.1893和No.1403这两种真菌对4种植物病害真菌和5种细菌的拮抗作用、次生代谢产物的抑菌效果以及对斜纹夜蛾三龄幼虫的毒杀作用,结果发现,其中No.1893的乙酸乙酯粗提取物对4种测试真菌和5种细菌没有抑制活性,对斜纹夜蛾三龄幼虫(Spodoptera litura)也没有胃毒作用。在触杀作用方面,当No.1893的粗提取物药液浓度达到1mg/mL时,斜纹夜蛾三龄幼虫表现出麻痹症状,虫体收缩。但经过2-3小时后,斜纹夜蛾三龄幼虫又恢复正常,第7天后,处理组和对照组的试虫体重差异不显著。这表明No.1893粗提取物对斜纹夜蛾三龄幼虫触杀作用不明显,不能将斜纹夜蛾三龄幼虫杀死。对峙培养试验结果表明No.1403是水稻稻瘟病菌(M.grisea)、香蕉炭疽盘长孢菌(G.musarium)、香蕉枯萎病菌(F.oxysporum f sp.cubense)等3种植物病原菌的拮抗菌。它的发酵液乙酸乙酯粗提取物除对以上3种植物病原菌有抑制作用外,还能有效的抑制青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella lignieres)等5种细菌,但对斜纹夜蛾三龄幼虫(S.litura)没有毒性。同时,还用多级质谱对该菌的乙酸乙酯粗提取物的化学成分进行了鉴定,发现其乙酸乙酯粗提取物中含有葸醌类抗生素1,4,5,6,7,9-hexahydroxy—2-methoxy—7-methyl—5β,9β,8aβ,6α,10aα—hexahydroanthracen-10(10aH)—one(Halorosellinia A)和1,4,6-trihydroxy—2-methoxy—7methylanthracene—9,10-dione,另外还推断出真菌No.1403也会产生beauvericin、fumonisin A2或者fumonisin A3、α—Zearalanol—d4或β—Zearalanol—d4。
3、海洋真菌No.1403在室内和室外能有效的防治香蕉枯萎病菌。在室内进行对峙培养,试验结果表明No.1403可以控制香蕉枯萎病菌的扩散,是香蕉枯萎病菌的拮抗菌。它的发酵液乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌也有抑制作用,当带毒培养基中含粗提物浓度为0.5mg/L时,粗提物对香蕉枯萎病菌的抑制率达到50%。田间试验结果显示,香蕉接种病原菌前一周,接种1403的分生孢子、发酵液和两者的混合物,7周后,各处理香蕉的叶片校正病情百分数为0%、20%和60%,其防病率分别达到100%、75%和25%;香蕉接种病原菌一周后,再接种1403的分生孢子、发酵液和两者的混合物,7周后,各处理香蕉的叶片校正病情百分数为50%、60%和20%,其治病率分别达到37.5%、25%和75%。这表明No.1403的分生孢子可以作为保护剂预防香蕉枯萎病菌的为害发生;发酵液和分生孢子的混合物可以作为治疗剂防治香蕉枯萎病菌的为害蔓延,两者可扩大推广应用。