论文部分内容阅读
红花玉兰(Magnoliawufengesis)是木兰科玉兰属多年木本植物,因其优异的花形和花色特征,而成为重要的城市园林绿化树种。本研究以红花玉兰品种’娇红1号’(JH1)为研究对象,针对不同花发育时期,利用转录组测序、HPLC色素分析、qRT-PCR表达分析、模式植物转基因等方法,探讨红花玉兰花青素苷合成途径的生理、生化和遗传基础,筛选并验证关键调控基因,为红花玉兰花色遗传改良提供依据。同时基于转录组数据,通过建立EST-SSR数据库,并结合公共数据库开发分子标记,开发针对红花玉兰品种开发和鉴定的综合分子标记体系,为开展红花玉兰的分子辅助育种提供技术支持。本研究主要取得了以下成果:1、通过对红花玉兰JH1五个发育时期(S1-S5)的花色定性定量分析发现,花青素苷在S2时期显著上调,并在S3期达到顶峰;通过表皮细胞观察,发现花青素的积累来源于单细胞内花青素苷含量上升和红色细胞数增多;2、通过对红花玉兰花青素苷的液相-质谱定性分析,一共发现5个主要花青素苷类物质,分别为三个矢车菊素苷类物质;一个芍药素苷类物质;一个飞燕草素苷类物质。说明红花玉兰花青素苷合成途径包含了矢车菊素苷和飞燕草素苷两个途径;3、利用Illumina高通量转录组测序技术(RNA-seq),对红花玉兰不同发育阶段整花进行转录组深度测序,通过从头拼接(De novo)并利用Nr,SwissProt,GO和KEGG对拼接的基因(unigene)进行注释,获得高质量的红花玉兰转录组数据库;4、通过差异表达分析,首次揭示了红花玉兰花不同发育阶段的生理生化过程的遗传基础,确定了 S2时期是红花玉兰花发育及花色形成的关键时期;同时通过趋势聚类分析,筛选出两个重要的花青素苷次生代谢相关的表达模式;5、重点挖掘红花玉兰花青素苷合成相关途径的结构基因,较完整的阐释了发育过程中红花玉兰花青素苷合成途径各关键合成酶编码基因的调控过程,并发掘了大量bHLH,MYB家族的转录因子编码基因,为未来进一步研究基因互作,全面了解红花玉兰花青素苷的遗传调控网络,提供了候选研究基因库;6、筛选出红花玉兰花青素调控相关的关键基因MwMYB1。通过生物信息学分析,预测了该基因的保守结构域和启动子调控与元件,结合进化树比对和亚细胞定位试验,表明该基因编码蛋白为一个R2R2-MYB转录因子;7、阐明了R2R3 MYB基因MwMYB1的生物功能,验证该基因在红花玉兰本体的表达模式:花被片中该基因主要在S2期表达,并持续至S4;除去花被片,该基因还在红花玉兰心皮、幼叶和叶柄等器官有表达;通过MwMYB1过表达转基因烟草和拟南芥表型分析,表明MwMYBl具有促进植物花青素苷合成的重要功能,并可能参与花青素苷合成的光依赖途径,同时更可能通过与TT8基因互作产生生物功能;通过对MwMYB1启动子功能分析研究了MwMYB1的潜在调控途径,一方面证明MwMYB1的表达部位包括花萼,心皮和叶片;另一方面表明MwMYB1可能受到ABA信号调控;8、基于转录组数据库首次构建了红花玉兰EST-SSR分子标记体系,并分析了红花玉兰EST-SSR的基本特征。通过筛选其中花青素苷合成相关的EST-SSR分析了五个红花玉兰品种的遗传特性,证实EST-SSR的可靠性同时,也反应出了 EST-SSR与表型的良好关联性。同时,通过应用筛选出的EST-SSR于其他同科植物,证明了红花玉兰EST-SSR较好的跨物种通用潜力。9、基于鹅掌楸数据库,构建了应用于红花玉兰品种的SSR分子表标记系统;基于SRAP通用引物数据库,构建了应用于红花玉兰品种的SRAP分子标记系统;结合EST-SSR,建立红花玉兰的综合分子标记体系。上述研究结果表明,红花玉兰花青素苷合成的关键时期为S2期,并由主要包含5个花青素苷类物质。本研究首次利用Illumnia测序技术对红花玉兰进行高通量测序,基于测序获得的相关序列,利用基因差异表达分析结合qRT-PCR技术分析基因的表达模式,最终筛选并验证了关键调控基因。最终,本研究全面解析了红花玉兰青素苷合成途径基本遗传和生化基础。同时,发掘转录组数据,首次开发了红花玉兰EST-SSR分子标记体系,构建红花玉兰综合分子鉴定体系。这些工作,均为花色改良及分子辅助育种提供宝贵遗传信息和有效工具,具有重要的理论及实际意义。