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脓毒症(sepsis)是影响多种器官功能的全身炎症反应,严重的脓毒症可导致脓毒性休克,并危及生命。呼吸系统是最易受到累及的器官系统,将近50%的严重脓毒症患者可以发展为急性肺损伤(ALI),甚至急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。其中,肺实质弥漫性炎症和严重的肺功能障碍是导致多脏器功能衰竭和脓毒症死亡的首要原因。急性肺损伤涉及多个病理过程,其中包括:血管完整性缺失,中性粒细胞浸润,富蛋白液在肺内堆积。尽管对于脓毒症潜在的病理产生机制的研究已有不同程度的进展,但并未完全明确。因此,对于脓毒症急性肺损伤的有效防治,仍是亟待解决的临床问题。近年来,对于热休克蛋白70家族新成员热休克蛋白A12B(HSPA12B)的研究受到关注。HSPA12B主要表达于内皮细胞,并且广泛分布在哺乳动物不同的组织内。大量研究表明HSPA12B可以保护不同危险因素对于内皮细胞的侵害,比如脑缺血再灌注损伤,心脏功能障碍等。除此之外,HSPA12B可以减弱LPS诱导的内皮细胞损伤;并且,HSPA12B作为一种新型的内皮生物标志物,可以一定程度上预测脓毒症及严重脓毒症患者的预后。但是,HSPA12B对脓毒症时肺内皮功能有无保护作用及其可能的机制,尚未完全明确。本研究拟通过在体与离体实验,探讨HSPA12B对脓毒症肺血管内皮损伤小鼠的影响及其可能的作用机制。首先,验证经鼻吸入HSPA12B siRNA对脓毒症小鼠肺组织内HSPA12B表达的干扰效率;其次,探讨HSPA12B对脓毒症肺损伤模型小鼠生存率,病理损伤及炎症反应的影响;最后,进一步探讨HSPA12B对脓毒症肺血管内皮损伤产生影响可能的机制。第一部分经鼻吸入HSPA12B siRNA对小鼠在体干扰效率的验证目的验证HSPA12B siRNA经鼻吸入后对小鼠肺内HSPA12B表达的影响及其干扰效率。方法将C57BL/6小鼠随机分为2组,分别经鼻吸入经过2-Ome修饰的HSPA12BsiRNA和阴性对照siRNA(Negative Control siRNA,NC siRNA),24h后取小鼠心脏、肺、肝、肾组织,应用RT-q PCR法及Western blot法分别检测小鼠不同组织内HSPA12B m RNA表达及肺组织内HSPA12B蛋白的表达水平。结果1.HSPA12B siRNA经鼻吸入的C57BL/6小鼠,不同组织(心脏、肺、肝脏、肾脏)内HSPA12B m RNA的表达水平较NC siRNA组小鼠呈现不同程度地降低,但肺组织表达水平明显降低(p<0.05)。2.HSPA12B siRNA经鼻吸入的C57BL/6小鼠,肺组织内HSPA12B蛋白的表达水平较NC siRNA组小鼠明显降低(p<0.05)。结论经鼻吸入HSPA12B siRNA对小鼠肺内HSPA12B表达具有下调作用,并可有效地将敲减作用特异性发挥于肺组织,为后续实验提供了可靠的依据。第二部分HSPA12B对脓毒症肺损伤模型小鼠生存率的影响目的研究HSPA12B体内敲减对脓毒症肺损伤模型小鼠生存率的影响。方法将C57BL/6小鼠随机分为4组,每组15只,分别为:阴性对照组(Sham组)、CLP模型组(CLP组)、CLP+HSPA12B siRNA组(HSPA12B干扰组)、CLP+NC siRNA组(NC干扰组)。经鼻吸入经过2-Ome修饰的HSPA12B siRNA和阴性对照siRNA(NC siRNA),24h后行CLP术,并于术后连续7天观察不同处理组小鼠的生存率,并绘制生存曲线。结果经过连续7天观察和记录的生存率显示:HSPA12B干扰组小鼠生存率为0,明显低于NC siRNA(生存率为40%)组,CLP组(生存率为33.33%)和Sham组(生存率为100%)(p<0.05)。结论HSPA12B体内敲减明显增加脓毒症肺损伤小鼠的死亡率,说明HSPA12B在脓毒症诱导的肺损伤中具有一定的保护作用。第三部分HSPA12B对脓毒症肺损伤模型小鼠肺病理损伤及炎症反应的影响目的探讨HSPA12B体内敲减对脓毒症肺损伤模型小鼠肺病理损伤及炎症反应的影响。方法将C57BL/6小鼠随机分为4组,每组8只,分别为:阴性对照组(Sham组)、CLP模型组(CLP组)、CLP+HSPA12B siRNA组(HSPA12B干扰组)、CLP+NC siRNA组(NC干扰组)。经鼻吸入经过2-Ome修饰的HSPA12B siRNA和阴性对照siRNA(NC siRNA)24h后行CLP术。1.于术后24h和48h取小鼠肺组织行HE染色,并进行病理学评分。2.于术后24h行支气管肺泡灌洗,通过ELISA法检测炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α水平。3.于术后24h行支气管肺泡灌洗,通过ELISA法检测MPO活性及流式细胞术进行中性粒细胞和肺泡单核巨噬细胞计数。4.于术后24h取小鼠肺组织,行湿/干比重检测。结果1.HE染色结果显示:HSPA12B干扰组小鼠肺部病理损伤明显加重,并且CLP术后24h损伤程度强于术后48h,且病理学评分明显高于其他处理组(p<0.05)。2.ELISA结果表明:HSPA12B干扰组小鼠较其他处理组小鼠支气管肺泡灌洗液内炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α水平明显增高(p<0.05)。3.HSPA12B干扰组小鼠肺内MPO活性和中性粒细胞计数明显升高(p<0.05)。4.湿/干比检测:HSPA12B干扰组湿干比明显升高,呈现肺水肿表现。(p<0.05)。结论HSPA12B体内敲减明显增加脓毒症小鼠肺病理损伤及炎症反应强度,表明HSPA12B在脓毒症肺内皮损伤具有重要作用。第四部分HSPA12B对脓毒症肺内皮损伤保护作用可能机制目的探讨离体和在体条件下HSPA12B表达对脓毒症肺内皮损伤保护作用的可能机制。方法1.将C57BL/6小鼠随机分为4组,每组8只,分别为:阴性对照组(Sham组)、CLP模型组(CLP组)、CLP+HSPA12B siRNA组(HSPA12B干扰组)、CLP+NC siRNA组(NC干扰组)。经鼻吸入经过2-Ome修饰的HSPA12B siRNA和阴性对照siRNA(NC siRNA)24h后行CLP术。术后24h收集小鼠肺组织,通过TUNEL染色检测肺内皮细胞的凋亡情况;并通过Western Blot实验检测MAPKs通路相关分子的表达。2.离体条件培养HUVEC,并通过瞬时转染p IRES2-EGFP-HSPA12B-3Flag高表达质粒和HSPA12B siRNA,之后给予LPS(1μg/ml)刺激,12h后Western Blot检测MAPKs通路相关分子的表达情况。结果1.TUNEL染色显示:HSPA12B干扰组较其他处理组内皮细胞凋亡明显增多,凋亡系数明显升高(p<0.05)。2.Western Blot结果显示:HSPA12B抑制ERK磷酸化表达。结论HSPA12B可能通过ERK/MAPK介导的信号通路影响炎症反应,及抑制内皮凋亡,从而保护脓毒症肺损伤时内皮的相关功能。