目的:哮喘是儿童最常见的慢性疾病之一,调查显示:婴儿期患呼吸道合胞病毒（RSV）或鼻病毒（RV）感染是儿童期过敏性哮喘发生的最主要危险因素,机制尚不清楚;RSV是婴幼儿下呼吸道感染的最重要病原,在出生后3到6个月的细支气管炎患儿中,80%以上是由RSV感染引起的,所以,RSV感染与儿童过敏性哮喘之间的关系尤其值得重视。小鼠肺炎病毒（PVM）与人类RSV同属于副粘病毒科,肺病毒属,尽管两种病毒编码的蛋白质之间几乎没有直接的氨基酸序列同源性,但PVM复制能力强,接种小量病毒就可以引发症状性疾病,且PVM感染小鼠能够复制人类感染RSV后的大部分症状。本研究利用PVM感染新生期小鼠,在幼年期用过敏原鸡卵清蛋白OVA激发建立动物模型,研究新生期呼吸道病毒感染联合变应原致敏促进幼年期过敏性哮喘的机制。方法:1. PVM的培养和滴定:在6周龄雌性BALB/c小鼠体内培养PVM病毒,培养乳仓鼠肾细胞（BHK-21）,用于PVM的滴度测定。2. 新生期PVM感染联合OVA致敏是否促进幼年期过敏性哮喘的发生2.1 实验动物分组、致敏和激发:出生3-5天（记为第0天）的BALB/c乳鼠,随机分为4组:PBS、PBS-OVA、PVM、PVM-OVA组,于第0、3、4天鼻腔吸入致敏,21-25天鼻腔吸入OVA激发,进行相应检测。2.2 肺功能检测:气道阻力和肺顺应性。2.3 取肺组织,做病理切片,H&E染色;荧光定量PCR检测IL-1、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α、IFN-γ的表达水平。3. 新生期PVM感染联合OVA致敏是否诱导肺Trained CD11b⁺细胞生成3.1 实验动物分组、致敏:出生3-5天（记为第0天）的BALB/c乳鼠,随机分为2组:PBS、PVM-OVA组,于第0、3、4天鼻腔吸入致敏,21天取肺单个细胞,用流式细胞仪检测。3.2流式细胞仪检测小鼠肺细胞CD69、TLR4、CD11b、CD11c、CD49a、Siglec F。3.3磁珠分选小鼠肺CD11b⁺细胞,OVA或LPS体外刺激5 h,流式细胞仪检测表面活化标志分子CD69、TLR4,荧光定量PCR检测细胞因子IL-1、TNF-α、MCP-1、GRO-α。4.过继转移Trained CD11b⁺细胞,是否影响过敏性哮喘的发生4.1实验动物分组、致敏和激发:PVM-OVA组21天后,磁珠分选Trained CD11b⁺细胞,经尾静脉注射过继转移至同龄正常小鼠,24 h后鼻腔吸入OVA连续激发5天,进行相应检测。4.2肺功能检测:气道阻力和肺顺应性。4.3取肺组织,做病理切片,H&E染色;荧光定量PCR检测IL-1、IL-5、IL-13、IL-17、TNF-α、IFN-γ的表达水平。5.新生期PVM感染联合OVA致敏是否通过影响细胞代谢途径而影响Trained CD11b⁺细胞的形成5.1实验动物分组、致敏和激发:出生3-5天（记为第0天）的BALB/c乳鼠,随机分为3组:PVM-OVA+Rapamycin、PVM-OVA+BPTES、PVM-OVA组,于第0、3天鼻腔吸入致敏,2 h后腹腔注射抑制剂Rapamycin或BPTES,第4天仅鼻腔吸入致敏,21-25天鼻腔吸入OVA激发,取肺单个细胞,用流式细胞仪检测。5.2流式细胞仪检测肺CD11b⁺细胞。6.通过抑制细胞代谢途径而抑制Trained CD11b⁺细胞的生成,是否抑制过敏性哮喘6.1实验动物分组、致敏和激发:出生3-5天（记为第0天）的BALB/c乳鼠,随机分为3组:PBS、PVM-OVA+Rapamycin、PVM-OVA+BPTES、PVM-OVA组,于第0、3天鼻腔吸入致敏,2 h后腹腔注射抑制剂Rapamycin或BPTES,第4天仅鼻腔吸入致敏,21-25天鼻腔吸入OVA激发,取肺单个细胞,用流式细胞仪检测。6.2肺功能检测:气道阻力和肺顺应性。6.3胞流式细胞仪检测肺泡灌洗液细胞表面标志F4/80、CD11b、Gr-1。取肺组织,做病理切片,H&E染色;荧光实时定量PCR检测IL-1、IL-5、IL-13、IL-17、TNF-α、IFN-γ、MCP-1的表达水平。7.在OVA激发阶段抑制细胞的代谢途径,是否抑制过敏性哮喘7.1实验动物分组、致敏和激发:出生3-5天（记为第0天）的BALB/c乳鼠,随机分为4组:PBS、PVM-OVA+Rapamycin、PVM-OVA+BPTES、PVM-OVA组,于第0、3、4天鼻腔吸入致敏,21、23、25天用OVA激发的同时腹腔注射Rapamycin或BPTES,22、24天只鼻腔吸入OVA激发,进行相应检测。7.2肺功能检测:气道阻力和肺顺应性。7.3流式细胞仪检测肺泡灌洗液细胞表面标志F4/80、CD11b、Gr-1。取肺组织,做病理切片,H&E染色;荧光实时定量PCR检测IL-1、IL-5、IL-13、IL-17、TNF-α、IFN-γ、MCP-1的表达水平。结果:1.制备的PVM滴度为TCID50=10^3.5/ml。2.新生期PVM感染联合OVA致敏促进幼年期过敏性哮喘的发生2.1气道高反应性:PVM-OVA组较PBS、PBS-OVA、PVM组气道阻力（RI）明显升高;PVM-OVA组较PBS、PBS-OVA组肺顺应性（Cdyn）明显降低。2.2肺组织病理变化:PVM-OVA组与PVM、PBS-OVA、PBS组相比,肺组织肺泡腔及支气管周围炎症细胞浸润增多,肺泡结构不完整。2.3 PVM-OVA组TNF-α、IFN-γ、IL-17的表达水平与PBS组相比显著升高,TNF-α、IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-17与PBS-OVA组相比显著升高,IL-1、IL-5、IFN-γ、IL-17与PVM组相比显著升高,PVM-OVA组IL-5的表达水平与PBS组相比显著降低;PBS-OVA组IL-1的表达水平与PVM组相比显著升高,TNF-α、IL-5、IL-13、IFN-γ显著降低;IL-13的表达水平与PBS组相比显著降低。3.新生期PVM感染联合OVA致敏诱导肺Trained CD11b⁺细胞生成3.1 与PBS组相比,PVM-OVA组诱导的CD11b⁺细胞显著增多。3.2 PVM-OVA组的CD11b⁺细胞包括少量的CD11c⁺树突状细胞（DC）、CD11c^–Siglec F⁺肺泡巨噬细胞、CD11c⁺Siglec F⁺粒细胞。3.3 与PBS组相比,PVM-OVA组CD11b⁺细胞表达的表面活化标志分子CD69、TLR4显著增加。3.4 Trained CD11b⁺细胞OVA或LPS体外刺激后,PVM-OVA组CD11b⁺细胞表面的CD69⁺或/和TLR4⁺的表达水平与PBS组相比显著增加。3.5 与PBS组相比,OVA体外刺激后,PVM-OVA组GRO-α的表达水平显著升高,LPS体外刺激后,PVM-OVA组MCP-1的表达水平显著升高。4. 过继转移Trained CD11b⁺细胞,促进过敏性哮喘的发生4.1 过继转移Trained CD11b⁺细胞,小鼠的气道阻力明显升高,肺顺应性明显降低。4.2 肺组织病理变化:过继转移肺Trained CD11b⁺细胞,小鼠肺组织肺泡结构不完整,有轻微的炎性细胞浸润。4.3 过继转移Trained CD11b⁺细胞后,与PBS组相比,小鼠肺组织的IL-5的表达水平明显下降,MCP-1的表达水平显著上升。5. 致敏的同时给予Rapamycin或BPTES,均可以通过抑制细胞代谢途径而抑制Trained CD11b⁺细胞的生成6. 通过抑制细胞代谢途径而抑制Trained CD11b⁺细胞的生成,可以抑制过敏性哮喘6.1 致敏时给予Rapamycin或BPTES可以抑制气道高反应性。6.2 肺组织病理变化:致敏时给予Rapamycin或BPTES可以显著减轻小鼠肺部炎症,支气管周围的炎症浸润细胞明显减少。6.3 致敏时给予Rapamycin会抑制肺泡灌洗液细胞中性粒细胞（F4/80^-CD11b⁺Gr-1⁺）的比例,给予BPTES会抑制嗜酸性粒细胞（F4/80^-CD11b⁺Gr-1^-）的比例。6.4 PVM-OVA+Rapamycin组IL-5、IL-13、TNF-α、MCP-1的表达水平与PVM-OVA组相比明显升高,IFN-γ的表达水平明显降低。6.5 PVM-OVA+BPTES组IL-13的表达水平与PVM-OVA组相比明显升高,IL-1、TNF-α、IFN-γ、MCP-1的表达水平明显降低。7. 在OVA激发阶段抑制Trained CD11b⁺细胞的代谢途径,也可以抑制过敏性哮喘7.1 激发时给予Rapamycin或BPTES,可以抑制气道高反应性。7.2 肺组织病理变化:激发时给予BPTES可以显著减轻小鼠肺部炎症,给予Rapamycin并未减轻小鼠肺部炎症。7.3 激发时给予Rapamycin会抑制肺泡灌洗液细胞中嗜酸性粒细胞（F4/80^-CD11b⁺Gr-1^-）的比例,给予BPTES抑制中性粒细胞（F4/80^-CD11b⁺Gr-1⁺）和嗜酸性粒细胞（F4/80^-CD11b⁺Gr-1^-）的比例。7.4 PVM-OVA+Rapamycin组IL-13、MCP-1的表达水平与PVM-OVA组相比明显升高,IL-1、TNF-α的表达水平明显降低。7.5 PVM-OVA+BPTES组MCP-1的表达水平与PVM-OVA组相比明显升高,IL-1、TNF-α、IFN-γ的表达水平明显降低。结论:1.新生期PVM感染联合OVA致敏促进幼年期过敏性哮喘发生。2.新生期PVM感染联合OVA致敏诱导肺Trained CD11b⁺细胞产生。3.过继转移肺Trained CD11b⁺细胞介导过敏性哮喘的发生。4.新生期呼吸道病毒感染联合变应原致敏通过诱导trained CD11b⁺细胞来促进幼年期过敏性哮喘。