【摘 要】
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研究背景肝脏是人体最大的腺体,在新陈代谢和免疫平衡中起着核心作用。这个器官负责200多项功能,如解毒、储存、凝血、产生能量营养转化和激素平衡。这些重要的生理功能使肝脏成为严重创伤（如脓毒症）后宿主生存的关键器官。近年来越来越多的数据发现在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）导致的免疫功能紊乱中巨噬细胞的极化发挥着重要的作用,但是目前还没有针对LPS所致急性肝损伤的具体治疗干预措施
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研究背景肝脏是人体最大的腺体,在新陈代谢和免疫平衡中起着核心作用。这个器官负责200多项功能,如解毒、储存、凝血、产生能量营养转化和激素平衡。这些重要的生理功能使肝脏成为严重创伤（如脓毒症）后宿主生存的关键器官。近年来越来越多的数据发现在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）导致的免疫功能紊乱中巨噬细胞的极化发挥着重要的作用,但是目前还没有针对LPS所致急性肝损伤的具体治疗干预措施。所以进一步了解肝损伤的分子机制为其早期诊断和新的治疗策略提供分子生物标志物具有极其重要的意义。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）是一类转录本长度超过200核苷酸的RNA分子,其表达受发育调控,在基因转录及表观遗传调控中发挥着关键的作用,但其在LPS诱导的急性肝损伤中的分子作用机制尚不完全清楚。尽管通过转录组分析已在某些疾病中鉴定出Gm26917的表达变化,但迄今为止关于Lnc RNA Gm26917的功能研究较少,且在急性肝损伤中的发生发展的具体作用机制尚未有报道。研究目的:探究lnc RNA Gm26917在LPS诱导的急性肝损伤中的生物学作用及作用机制研究内容:（1）高通量测序筛选及验证LPS诱导的小鼠急性肝损伤模型中差异表达的lnc RNA:首先根据RNA-seq结果筛选在急性肝损伤中有差异性的lnc RNAs,并用q PCR在LPS处理的肝脏组织巨噬细胞中验证,确定最终的研究对象,即目标长链非编码RNA;（2）目标lnc RNA Gm26917的鉴定及在巨噬细胞中的定位:根据测序结果筛选及在LPS诱导的肝损伤标本验证,确定研究Gm26917。荧光原位杂交技术（FISH）用以明确Gm26917在巨噬细胞中的定位;（3）体内实验验证Gm26917在急性肝损伤中的作用:通过尾静脉注射慢病毒的方式敲低Gm26917,观察小鼠肝损伤的情况;（4）体外实验探讨Gm26917在巨噬细胞中作用:RNA-seq及q PCR探索及验证敲低Gm26917对巨噬细胞炎症免疫反应的影响;流式细胞仪分析敲低Gm26917对巨噬细胞极化的影响;（5）筛选及验证Gm26917与ANXA1的相互作用:经cat RAPID数据库筛选Gm26917可能结合的蛋白,并在LPS处理的巨噬细胞中用RIP-q PCR及荧光原位杂交和免疫荧光共染色技术验证,确定Gm26917与ANXA1的相互作用;（6）探讨Gm26917促进巨噬细胞炎症反应的机制:分别敲低和过表达Gm26917检测ANXA1总蛋白表达,蛋白印迹检测Gm26917对ANXA1泛素化的影响。荧光素酶报告基因检测Gm26917对NF-κB的影响,WB检测Gm26917对p-65和IKK-α磷酸化的影响;（7）探究FOXM1在巨噬细胞中可以调控Gm26917的表达:蛋白质印迹及q PCR检测FOXM1敲低效率,q PCR检测敲低FOXM1后Gm26917及炎性因子的表达;CHIP-q PCR验证Gm26197受转录因子FOXM1的调控,研究结果:（1）Lnc RNA Gm26917在LPS刺激的肝巨噬细胞和腹腔巨噬细胞中均高表达。荧光原位杂交实验证明Gm26917定位在巨噬细胞细胞质中;（2）体外实验证实慢病毒介导的Gm26917沉默能够减轻肝脏炎症并保护小鼠免受LPS诱导的急性肝损伤;（3）体内实验证实Gm26917是巨噬细胞炎症反应的重要调节因子。si RNA介导的Gm26917沉默可减轻巨噬细胞的炎症,并降低巨噬细胞的吞噬功能和趋化能力Gm26917;且敲低Gm26917可促进巨噬细胞从促炎性M1型向代替激活的M2型分化;（4）Gm26917 3’截短体与膜联蛋白A1的N末端相互作用;（5）敲低Gm26917通过降低膜联蛋白A1的泛素化及其与NEMO的相互作用来抑制NF-κB的活性;（6）Gm26917影响K6、K11、K29、K33和K63分支泛素链的形成,而K27和K48分支泛素链不受影响。（7）Gm26917在炎性巨噬细胞中的表达受到FOXM1的调节。LPS处理显著增加FOXM1与巨噬细胞Gm26917启动子区的结合。结论:Gm26917在LPS诱导的急性肝损伤中通过促进膜联蛋白A1的泛素化来调节巨噬细胞分化,可能是治疗炎症性肝病的潜在治疗靶点。
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