羊毛甾醇14α-去甲基化酶(P45014DM)是抗真菌药物作用的重要靶标,该酶的抑制剂氮唑类化合物是抗真菌药物研究中的重要热点领域。先后出现了酮康唑、氟康唑、伊曲康唑和活力康唑等一系列主要临床药物[1-4]。氟康唑的抗菌谱相对较窄,对曲霉菌等真菌活性很低,且易产生耐药性;伊曲康唑也存在口服生物利用度不稳定等问题。随着临床上非白色念珠菌感染率迅速增加,以及氟康唑耐药菌株的不断出现,迫切需要开发出新一代广谱、低毒、高效的氮唑类抗真菌药物。但是,目前,国内外专家仅限于知道氮唑类药物是靶酶作用底物的不可逆、竞争性抑制剂;通过氮唑环上氮原子与靶酶的血红素辅基Fe原子形成配位键结合,使血红素失去与氧原子结合的机会,阻断底物的羟基化反应,致使真菌体内麦角甾醇合成受阻,导致膜通透性和膜上多种酶活性改变,从而抑制真菌的生长。对氮唑类药物的抗菌活性分子机理研究较少。而氮唑类抗真菌药物的作用分子机理又是该类药物创新性研究的核心技术;因此,近年来国内外学者在这方面进行了大量的探索工作[5-7]。据报道,氮唑类药物的分子结构中,三唑环上的4位N原子与靶酶活性位点卟啉Fe原子配位结合,间二氟苯基与靶酶活性位点的疏水空穴形成疏水相互作用,叔醇羟基为该类药物产生活性所必需;而结构中变化最大,构效关系最不明确的是其侧链部分[3,4-7]。目前已经报道有十几种结构类型的侧链,并且有多个结构差异很大的类型显示有较强的抗真菌活性。其中,发现艾迪康唑等高活性化合物分子结构中的2位叔醇羟基和3位侧链是两个活性极其重要部位,2位叔醇羟基为该类化合物产生活性所必须,但其究竟在药物与靶酶活性位点的识别和定位中起何作用,目前还不清楚;分子结构中3位侧链部分是目前抗真菌药优化设计的主要部位,同时又发现其对药物的抗真菌活性影响很大,这一效应用国内外建立的靶酶三维结构都无法解释其作用机理[4,5]。因此,目前该类药物分子作用机制研究亟待解决的主要问题是:氮唑类抗真菌药物分子结构中2位叔醇羟基和3位侧链R与靶酶的作用模式。正确地阐明2位叔醇羟基和3位侧链与靶酶作用模式,有可能给该类药物创新设计带来重大突破。本课题前期在CACYP51靶酶研究方面,在国内外率先建立了一套集分子设计、化学合成和活性筛选三大系统为一体的抗真菌药物计算机辅助设计系统,成功地模建了白色念珠菌羊毛甾醇14α去甲基化酶的三维结构,并以此为基础进行了作用活性位点的深入研究。研究中发现酶与底物的对接模型中Tyr118、Ser378、His310三个氨基酸残基在靶酶与底物、靶酶与唑类衍生物侧链(2位叔醇羟基、3位侧链)相互作用中起重要作用,并且与我们设计合成的C3侧链修饰的化合物有良好的选择性。本课题既是为证明我们前期分子模型研究结果的合理性,以阐明以上的难题。为进一步解释Tyr118、Ser378、His310在CACYP51与不同唑类衍生物侧链作用方式,我们进行以下工作:1.删除酵母表达株内源性ERG11基因:本研究为消除内源基因的影响,删除酵母基因工程菌Y12667中内源性的CYP51基因。在基因DNA水平、蛋白水平验证了删除的成功。并将外源基因转入酵母删除菌中,在生长和功能水平证明了外源同源基因与内源基因的互补性。确证内源基因被成功删除;外源基因能在基因删除菌中正常表达;外源同源蛋白与内源蛋白功能互补;建立了为下一步实验用的实验菌株。2.完成CYP51蛋白残基的突变、表达、定性及定量研究:本实验设计突变体Y118A、Y 118F、Y118T、S378A、S378T、H310A、H310R。并转入基因删除酵母菌中表达,获取表达的微粒体蛋白。Western鉴定显示野生型及突变体蛋白表达成功。突变点并未影响蛋白的抗原性。用分光光度法测定蛋白浓度,证明诱导表达量接近微粒体蛋白总量的25%。蛋白活性测定表明,表达的野生型蛋白有活性,对其天然底物的代谢能力为11.6nmol/min/mg pro, Y118(6.25/6.54/ 5.82nmol/min/mg),H310(6.74/6.40 nmol/min/mg)的突变体蛋白活性有不同程度的改变,其中活性最多可下降1/2左右;而S378(8.22/8.05 nmol/min/mg)的突变体蛋白活性变化较小。3.整体水平表达蛋白的功能研究分别测定不同突变衍生体蛋白对五个化合物:氟康唑、艾迪康唑、A1、A3、E2、E8的MIC80值和Spotting assay。与含野生型蛋白菌株相比,化合物对突变体菌株的抑制能力不同程度减弱。不同化合物对突变体的抑制效应有差异,与氟康唑相比艾迪康唑、A系和E系化合物的体外抗菌效果强, Y118突变体对受试药物艾迪康唑、A1、A3、E2、E8的敏感性较对氟康唑的作用效应明显下降;378残基对A3、E8化合物选择性强于氟康唑和艾迪康唑。H310突变则负影响所有化合物的抗菌性能。但实验中该批A1、E2化合物测试稳定稍差。因此,进一步实验优选了艾迪康唑、A3和E8作为受试药,氟康唑为对照药。用GC--MS分析甾醇代谢成份,进一步验证酶突变对细胞水平甾醇代谢的影响。生物活性以及化合物对靶酶突变衍生物的抑制效应的量化验证方式是酶对底物的代谢能力测定。本研究中建立了以NADP发生系统为启动因子、GC—MS为测定手段的酶活性和抑制剂的抑酶活性检测实验,离体酶实验结果(IC50)显示Y118残基对艾迪康唑和A,E系化合物的选择性比氟康唑强10倍以上;S378对受试化合物的选择性较Y118残基弱,但也表现出对侧链修饰中乙酰基、氰基和酰氨基集团的偏好(A,E系化合物)。H310突变体对所有含叔醇羟基的化合物的敏感性明显下降。拉曼光谱测定唑类衍生物侧链与靶酶氨基酸残基作用时的光学振动位移结果显示,与野生型游离酶蛋白比较、以及野生型酶蛋白与化合物复合物的拉漫光谱比较,突变体酶与化合物的复合物拉曼振动峰特征更接近野生型酶的非结合态,表明突变后化合物与酶的结合减少。结构分子生物学实验结果支持细胞水平和离体酶蛋白水平的实验结果。因此,所有的研究结果表明,Y118的苯环侧链与三唑醇类化合物的苯环的堆积作用影响酶与化合物的结合,影响酶的抗菌活性;S378残基的羟基基团与化合物的吸电子极性基团形成的氢键参与化合物与酶的正确结合;H310残基与叔醇羟基的氢键作用是化合物抗菌活性发挥的重要因素。证明前期模建模型预测的三个活性位点残基在酶与化合物的相互作用非常关键,与化合物的作用效果可以指导化合物优化设计。