研究背景:特发性肺纤维化（IPF）是典型的进行性纤维化间质性肺炎,是最常见的间质性肺疾病之一。但是IPF具体的发病机制尚未明确。目前尚未有有效的治疗药物,吡非尼酮和尼达尼布是FDA批准的治疗IPF的药物,但是有上消化道症状、光敏、皮疹、厌食和肝毒性等不良反应。2020年开始爆发流行的新型冠状肺炎（COVID-19）,在新型冠状肺炎死亡的病人肺组织中发现了肺纤维化在内的肺异常。这需要我们去寻找新的IPF的潜在的治疗靶点。载脂蛋白a1（Apo-A1）是HDL中含量最高的载脂蛋白。Apo-A1在IPF的病人肺组织内减少,给予Apo-A1后能缓解IPF动物模型的肺纤维化,提示Apo-A1是IPF治疗的潜在靶点。但是Apo-A1治疗因为涉及到伦理和提纯等多种现实问题无法在IPF病人中应用。D-4F是一种含有18个D氨基酸的多肽,是Apo-A1的拟似物,在心血管系统疾病替代Apo-A1治疗上展现出良好的效果。最新研究发现D-4F在肺泡上皮细胞中能抑制TGF-β 1介导的上皮间质转化。D-4F还能在巨噬细胞中抑制TGF-β 1的转录和翻译。这提示D-4F在体外实验中展现出了良好的抗肺纤维化的潜力。转录组学和脂质组学已经在IPF研究中得到了广泛的应用。IPF是一种由多种病因共同作用的结果,涉及到肺泡上皮细胞,成纤维细胞和免疫细胞等多种细胞。利用转录组学方法,可以系统的分析IPF的病理生理变化,寻找到分子标记物,寻找到新的机制。目前RNA-seq技术和单细胞RNA-seq技术均被用于IPF的研究,并为将来的IPF个体化治疗提供了潜在的靶点。脂质组学是由代谢组学发展起来的专门研究脂代谢的组学,通过脂质组学结果能让我们更加了解了肺纤维化中,特别是2型肺泡上皮细胞的代谢变化。本研究应用利用转录组学和脂质组学共同分析的方法,研究D-4F在动物体内干预肺纤维化中的基因和脂质变化,有助于阐述D-4F的作用机制。研究目的:1.使用小鼠肺纤维化模型研究D-4F在动物体内的抗纤维化作用。2.应用转录组学的方法,分析D-4F干预的小鼠肺纤维化模型肺组织中的基因变化,鉴定出与肺纤维化有关的差异基因和通路。3.应用脂质组学的办法,分析D-4F干预的小鼠肺纤维化模型肺组织中的脂质变化,鉴定出与肺纤维化有关的差异脂质和通路。4.运用生物信息学的方法,将转录组学和脂质组学的数据综合分析,找出D-4F作用的通路和可能的作用靶点。研究方法:一.Apo-A1的拟似物D-4F对小鼠肺纤维化模型的作用1.动物模型及分组:选用7周龄的C57/BL6雄性小鼠42只。将全部小鼠分为3组,每组14只,分为空白组,模型组和干预组。2.博来霉素诱导肺纤维化模型:小鼠麻醉后暴露气管。使用1ml注射器气管内注射,模型组和干预组给予60 μl,2mg/kg的博来霉素溶液,空白组给予等量的生理盐水。第二天起每天对干预组给予3mg/kg的D-4F腹腔注射,给予空白组和模型组等量的生理盐水,持续28天。28天后麻醉处死小鼠取材,取血清,肺组织病理学样本,肺组织转录组学样本和肺组织脂质组学样本。用生化分析仪测量各组小鼠的胆固醇,高密度脂蛋白胆固醇,低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯,用ELISA检测各组小鼠的血清TGF-β1水平,对肺组织病理学样本行HE染色,Masson染色和α-SMA组化染色。二.Apo-A1的拟似物D-4F对小鼠肺纤维化模型的转录组学分析1.取冻存的肺组织样本,组内混样后每组n=3。提取总RNA,构建cDNA文库,进行测序。测序所得到的基因,根据差异倍数≥2或＜0.5,且P＜0.05确定差异基因。并对差异基因进行gene ontology、KEGG分析。2.将空白组和模型组与模型组和干预组的差异基因进行共同分析,得到KEGG通路。三.Apo-A1的拟似物D-4F对小鼠肺纤维化模型的脂质组学分析1.取冻存的肺组织,震荡破碎组织后给予异丙醇-甲醇溶液（体积比1:1）复溶。分别采用正离子和负离子模式通过超高效液相色谱系统进行分离。采用软件LipidSearch 4.1.30分别对正负离子模式得到的数据,进行定性、定量分析。按照VIP＞1和P value＜0.05为筛选差异脂质。2.将空白组和模型组与模型组和干预组的差异脂质进行共同分析,得到KEGG通路。四.通过脂质组学和转录组学联合分析的方法研究Apo-A1的拟似物D-4F对小鼠肺纤维化模型的作用机制采用蛋白互相作用网络图分析脂质组学和转录组学的结果,寻找D-4F干预博来霉素诱导的肺纤维化模型的作用靶点。并对作用靶点行qRT-PCR验证。研究结果:一.Apo-A1的拟似物D-4F对小鼠肺纤维化模型的作用1.造模28天后,模型组小鼠死亡5只,干预组小鼠死亡2只,空白组小鼠无死亡。生存曲线分析显示干预组与模型组无统计学差异。模型组和干预组小鼠体重均比空白组轻,并且模型组小鼠的体重轻与干预组,有统计学差异。2.模型组小鼠的血清胆固醇显著性高于空白组,但是与干预组无差异。模型组小鼠的血清HDL-C显著性高于空白组,但是与干预组无差异。模型组小鼠血清LDL-C显著性高于空白组,干预组小鼠血清LDL-C显著性低于模型组。空白组,模型组和干预组小鼠血清甘油三酯的结果无差异。模型组小鼠血清TGF-β1的水平显著增高,与空白组、干预组相比有差异。3.HE染色示模型组肺组织结构变形严重,大部分肺组织被纤维组织替代。同一视野的Masson染色显示实变的肺组织中大量的红色的肌纤维和蓝色的胶原纤维。α-SMA染色可示大量肺组织实变,实变的肺组织中可见深染的颗粒。干预组HE染色显示肺组织受损,有纤维带和纤维小团,但是部分也能看到局灶增厚的肺泡。同一视野的Masson染色显示红色的肌纤维和蓝色的胶原纤维较少。α-SMA染色可见肺组织有纤维小团,部分区域显示局灶增厚的肺泡,纤维小团中较少有深染色的颗粒。空白组无异常表现。Ashcroft评分统计和平均光密度统计均显示模型组纤维化程度显著高于干预组和空白组。二.Apo-A1的拟似物D-4F对小鼠肺纤维化模型的转录组学分析1.空白组和模型组共检测出2179个差异基因,其中表达上调的基因有904个,表达下调的基因有1273个。模型组和干预组共检测出216个差异基因,其中表达上调的基因有78个,表达下调的基因有138个。2.将空白组,模型组和干预组进行共同分析,有99个差异基因同时出现在2组转录组结果中。将这99个差异基因行KEGG分析,得到了得到具有统计学差异的13条通路:细胞因子受体相互作用,甲型流感,类风湿性关节炎,麻疹,MAPK信号通路,胞质DNA感应通路,癌症中的转移失调,趋化因子信号通路,牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路,造血细胞系,Ras信号系统,Toll样受体信号通路和糖胺聚糖生物合成。三.Apo-A1的拟似物D-4F对小鼠肺纤维化模型的脂质组学分析1.其中空白组和模型组差异脂质有1100个,其中下调的脂离子有740个,上调的脂离子有360个。模型组和干预组差异脂质有92个,其中下调的脂离子有57个,上调的脂离子有35个。2.将空白组,模型组和干预组进行共同分析,有35个差异脂质同时出现在2组脂质组学结果中。将这35个差异脂质行KEGG分析,得到了 5条具有统计学意义的脂代谢通路:甘油磷脂代谢通路,糖基磷脂酰肌醇-锚定生物合成,自噬-其他,铁死亡和自噬-动物。3.为了寻找D-4F缓解肺纤维化的生物标志物,我们对空白组,模型组和干预组共同拥有的35个差异脂质行ROC曲线分析,得到各组的灵敏度,特异度和AUC,根据灵敏度＞0.8,特异度＞0.8和AUC＞0.8确定了 16个可以用于鉴别D-4F 作用效果的脂质分子。包括 DG（56:4）+H,DGDG（33:3）-H,GM3（d34:1）-H,LPC（20:2）+HCOO,LPS（24:0）+H,PC（17:4/22:1）+H,PC（20:1/22:6）+HCOO,PC（22:5/22:6）+HCOO,PE（16:Op/20:5）+H,PE（16:Op/22:6）-H,PE（18:2p/18:2）+H,phSM（d32:1）+H,SQDG（38:9）+HCOO,TG（15:2/18:2/21:6）+H,TG（18:Oe/18:2/22:2）+NH4和TG（18:Op/18:2/22:1）+NH4。四.通过脂质组学和转录组学联合分析的方法研究Apo-A1的拟似物D-4F对小鼠肺纤维化模型的作用机制1.我们综合分析空白组,模型组和干预组的共同差异基因和共同差异脂质。在脂质组学KEGG分析中,大部分差异脂质都参与了甘油磷脂代谢通路。因此我们做出甘油磷脂代谢通路的蛋白互相作用网络图。图中蛋白互相作用网络图中包含的差异基因为pla2g4c。2.我们采用qRT-PCR去验证基因pla2g4c,发现模型组pla2g4c表达增高,与空白组和干预组都有显著性差异。研究结论1.本研究在体实验的角度证明了 D-4F能通过降低外周血TGF-β 1水平来缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型。确定了 D-4F的抗纤维化的作用。D-4F可以作为将来治疗IPF的潜在的药物。2.本研究应用转录组学和脂质组学的方法,从RNA和脂质分子两个水平对D-4F缓解肺纤维化的作用机制进行了分析,揭示了甘油磷脂代谢和基因pla2g4c在D-4F干预中的重要作用,为了更加深入了解D-4F缓解肺纤维化的作用机制奠定了基础。