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棘球蚴病是严重危害人体健康的重要人畜共患寄生虫病,棘球蚴在体内的生长发育与致病机制尚不清楚。血管生成是寄生虫感染宿主后获取生长发育、成熟、繁殖所需营养的重要途径,主要受到虫源的或因寄生虫感染所致的宿主分泌的血管生成因子单独或联合调控。而棘球蚴感染是否引起宿主血管生成有待研究。髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)在棘球蚴感染后可富集,但是否具有其在肿瘤中的促血管生成作用尚不清楚。而棘球蚴感染导致宿主血管生成及其机制研究对包虫病的防治研究具有重要意义。本研究应用细粒棘球蚴感染小鼠模型,通过小鼠miRNA芯片和生物信息学方法开展单核髓源抑制性细胞(monocytic-type MDSC,M-MDSC)的microRNA表达谱分析并鉴定得到差异表达microRNAs、通过寄生虫和宿主两方面对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的成管作用及相关因子研究,从虫源和宿主两个方面初步了解细粒棘球蚴感染致宿主血管生成的作用。此外,棘球蚴病治疗药物单一,且治愈率不高,亟待寻找替代药物。血管生成抑制剂熊果酸通过直接损伤肿瘤细胞、诱导细胞凋亡、下调基质金属蛋白酶的表达等机制抑制血管生成,从而抑制肿瘤细胞生长、迁移和侵润。本研究通过熊果酸对体外培养的细粒棘球蚴原头节、生发层细胞和囊的作用,熊果酸对细粒棘球蚴感染小鼠的抑囊效果,以及熊果酸体内外抑制血管生成作用的初步研究,评价其作为抗棘球蚴药物的潜力。一、细粒棘球蚴感染小鼠单核髄源抑制性细胞microRNA表达谱分析通过小鼠miRNA芯片检测细粒棘球蚴感染小鼠和正常小鼠M-MDSC的microRNA表达谱,利用生物信息学方法对差异表达的28个microRNA进行靶基因预测,在TargetScan、PITA和microRNAorg数据库共计得到交集靶基因272个。GO分析显示,靶基因主要涉及胞内蛋白转运(intracellular protein transport)、蛋白靶向作用溶酶体(protein targeting to lysosome)和蛋白转运(protein transport)等生物学过程,主要位于胞浆(cytoplasm)、神经元细胞体(neuronal cell body)和膜结构(membrane)等,所涉及的分子功能主要包括蛋白质结合、金属离子结合和SH3结构域结合等。KEGG分析显示,这些差异的microRNA主要富集在内吞作用(Endocytosis)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)和轴突引导(Axon guidance)等通路上。同时,通过DIANA-miRPath3.0在线软件分析发现差异 microRNA 在 MAPK 信号通路(MAPK signaling pathway)、黏着通路(Focal adhesion pathway)、PI3K-Akt 信号转导通路(PI3K-Akt signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、mTOR 信号通路(mTOR signaling pathway)和TGF-β信号通路(TGF-β signaling pathway)等与免疫调控和血管生成相关的6条通路上有不同程度的富集,且包含共同的差异microRNA共计19条。此外,8个(8/10)下调microRNA在细粒棘球蚴感染小鼠和正常小鼠各3个样本的M-MDSC中得到荧光定量PCR的随机验证。以上发现表明细粒棘球蚴感染后富集的髓源抑制性细胞可通过microRNA调控其促血管生成作用。二、细粒棘球蚴感染致小鼠血管生成的初步研究通过免疫组化法显示CD31在宿主包裹棘球蚴囊的薄膜组织中比正常组织高表达,同时ELISA法检测VEGF在感染小鼠血清中的水平(548.100±134.200 pg/ml)显著高于正常小鼠(76.950±2.760pg/ml)(t = 4.109,P= 0.001)。鼠源细粒棘球蚴培养上清(F = 73.03,P<0.001)体外能显著促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管,细粒棘球蚴囊培养上清、原头节培养上清和囊液分别刺激HUVEC,RPMI-1640为空白对照,3 h后成管片段长度总和分别为棘球蚴囊组(13253±169)、囊液组(2838±410)、原头节组(7586±1694)和空白对照组(7497±709)。通过氨基酸序列比对与实时荧光定量PCR检测发现细粒棘球蚴囊壁和原头节中小鼠基质金属蛋白酶9(MMP-9)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)同源蛋白的表达存在差异,MMP-9在原头节中的转录水平高于棘球蚴囊(t=-11.654,P<0.001),而HMGB1在棘球蚴囊中的转录水平高于原头节(t= 6.433,P=0.003)。同时,感染小鼠多核髓源抑制性细胞(polymorphonuclear-typeMDSC,PMN-MDSC)培养上清(4873± 1436)与 RPMI-1640 组(3015±602)相比能显著促进HUVEC成管(P=0.028),但与与M-MDSC组(3941±1435)没有统计学差异(P=0.219),且M-MDSC组与RPMI-1640组之间也没有统计学差异(P= 0.243)。感染后小鼠脾脏 M-MDSC(t=12.98,P<0.001)和 PMN-MDSC(t =13.81,P<0.001)中VEGF的转录水平均高于正常组。结果表明,细粒棘球蚴感染小鼠后,可能通过虫源因素(包括棘球蚴囊分泌物等)和宿主因素(感染后的MDSCs等)调控棘球蚴寄生部位宿主的血管生成。三、熊果酸对细粒棘球蚴的体内外作用研究通过不同浓度的熊果酸对体外培养的细粒棘球蚴原头节、生发层细胞和囊的作用效果,发现细粒棘球蚴原头节经40 μg/ml熊果酸作用3天后,死亡率为45.95± 5.30%;熊果酸浓度高于10 μg/ml可抑制90%以上的生发层细胞活性;熊果酸对细粒棘球蚴囊的完整性亦造成损伤。经熊果酸作用后,细粒棘球蚴原头节、生发层细胞和囊的超微结构均发生明显变化。感染细粒棘球蚴的实验鼠经200和100 mg/kg的熊果酸治疗后,囊重抑制率分别为39.5%和38.3%,其中200 mg/kg治疗后的囊重同对照组相比有显著性差异(P= 0.0178)。除此之外,熊果酸体外能抑制HUVEC的增殖(F=25.69,P<0.001),且下调体内棘球蚴囊周围宿主组织的 CD31 表达、VEGF(t= 9.399,P<0.001)和 MMP-9(t = 8.746,P<0.001)mRNA表达,还可下调棘球蚴囊虫源的MMP-9(t = 3.380,P=0.004)和HMGB1(t= 6.377,P<0.001)的mRNA表达。结果表明,血管生成抑制剂熊果酸具有直接的抗棘球蚴作用,还可能通过抗血管生成因素抑制棘球蚴生长。结论1.细粒棘球蚴感染小鼠后引起MDSCs富集,其中该类细胞中的microRNA可能通过相关的信号通路参与MDSCs的血管生成调节作用。该研究是首次在寄生虫感染模型中研究MDSCs的microRNA血管生成调节功能,将为在microRNA水平深入研究MDSCs的血管生成调节功能提供分子基础。2.细粒棘球蚴可能通过虫源因素(包括棘球蚴囊分泌物等)和感染所致的宿主因素(感染小鼠的MDSCs等)调控棘球蚴寄生部位宿主的血管生成。该研究是首次发现细粒棘球蚴的促血管生成作用,也是首次在寄生虫感染模型中发现MDSCs的促血管生成作用,将为进一步从虫源和宿主两个方面研究细粒棘球蚴感染致寄生部位宿主血管生成及机制提供科学依据和思路。3.血管生成抑制剂熊果酸可能通过直接的抗细粒棘球蚴作用或间接通过抗宿主血管生成抑制棘球蚴生长。该研究是首次发现熊果酸的抗棘球蚴作用,将为棘球蚴病的临床治疗研究提供新思路,以及为熊果酸可能成为治疗棘球蚴病的有效药物提供科学依据。