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结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的人、畜、禽共患的慢性消耗性传染病,与艾滋病及疟疾共同成为人类健康的三大威胁。2013年,有900万人罹患结核病,150万人死于该病。随着耐药结核分枝杆菌的散播及艾滋病蔓延,对结核病的控制与防治面临着巨大挑战。但是,目前已报道的针对结核病的几种疫苗都有一定的局限性。接种卡介苗(BCG)是预防结核病的主要方式,但存在保护效率低、免疫保护效果有限等问题;DNA疫苗的有效性仍有待提高;亚单位疫苗的免疫应答持续时间短、应用受限,因此发展高效、安全并可广泛应用的新型结核疫苗已迫在眉睫。本研究通过构建细菌表面展示载体,在大肠杆菌表面展示结核分枝杆菌PepA、PPE18和EsxH蛋白,对其免疫效果进行研究,评价其作为活载体疫苗应用于结核病防控的潜力。本研究将PepA、PPE18和EsxH的编码基因rv0125、rv1196、rv0288及三个基因的融合基因rv0288-1196-0125分别克隆于构建的INP表面展示载体,转化至大肠杆菌,通过不同方法验证外源蛋白的表达定位和表达量。免疫印迹结果显示,三个编码基因及融合基因均有表达,可检测到预期大小的蛋白条带;对亚细胞组分的检测结果显示,目的蛋白均定位于细胞膜与细胞壁;进一步应用蛋白酶K作用后,特异性的目的蛋白被消化,被降解为许多小分子量氨基酸肽段;激光共聚焦显微镜下可观察到免疫染色后细菌表面的特异性荧光信号。以小鼠为动物模型,用所构建的表面展示活疫苗载体经腹腔注射免疫小鼠,定期采取血清、分离脾脏淋巴细胞,分别检测抗体水平、细胞因子水平、CD4+和CD8+水平,分析免疫效果。研究结果表明,与对照组相比,各免疫组抗体水平均有较大程度的提升,在三免二周后,INP-0288组的抗体水平为空载体对照组的4倍,既使抗体水平最低的INP-0288-1196-0125组也为空载体对照组2倍,显示上述表面展示活疫苗载体能刺激机体产生针对所展示蛋白的高水平特异性抗体。各免疫组CD4+T细胞呈现上升趋势,而对于CD8+T细胞,INP-0288免疫组呈现上升趋势,其余三组呈现上升后轻微下降的趋势,但水平均高于对照组;INP-0288组的CD4+/CD8+表现为上升后轻微下降的趋势,其余三组呈现出下降后上升的趋势。细胞因子水平存在明显差异:对于IFNγ,相比于空白组各免疫组水平均表现为下降,水平低于空白组;对于IL-4,各时间点各免疫组水平明显提高;IL-17A的检测中,相比于空白组,INP-0288组明显升高,而其余三组表现为水平降低。综上所述,本研究利用所构建的表面展示载体INP,将结核分枝杆菌PepA、PPE18、EsxH及其融合蛋白展示于大肠杆菌表面,所构建的4种蛋白表面展示活疫苗载体均能够在小鼠中激发强烈的体液与细胞免疫。本研究为新型结核疫苗的研制奠定了良好的基础,为结核病的防控提供了新的思路。