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柑橘黄龙病(Citrushuanglongbing,HLB)是世界范围内最具毁灭性的柑橘病害之一,给柑橘产业造成巨大经济损失,实现其现场快速检测具有重要意义。本课题以HLB最主要的病原菌Las(Candidatus Liberibacter asiaticus)为研究对象,着眼于其在现场检测中存在的问题,以核酸扩增技术为基础,对核酸提取、核酸扩增、扩增产物检测这三个模块的快速化、简洁化地完成进行研究,探索新型、简便、快速的Las现场检测方法。本论文的主要研究内容及结论如下:(1)建立了 Las实时荧光PCR(Polymerase Chain Reaction)检测方法。设计3组Las PCR引物并筛选出扩增效果最优的引物对,通过退火温度的调节解决PCR的非特异性扩增问题,最后评估了该体系的检测灵敏度,其灵敏度与目前较常用的OI1/OI2cPCR方法相当。综上,所建立的Las实时荧光PCR检测方法可代替OI1/OI2c PCR,用于Las的日常检测。(2)建立了 基于环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)的Las现场可视化检测方法。设计LAMP引物并优化LAMP体系,使得LAMP在35 min内完成。探究出氢氧化钠(Sodium hydroxide,NaOH)粗提取柑橘叶片核酸的最优条件为3 min裂解和50倍稀释。随后开发了一种新型的基于低浓度荧光染料的LAMP扩增产物可视化检测法,并设计了一个迷你荧光检测装置与之相配套。实验发现,可视化检测时的背景信号来源为易形成二级结构的高浓度高长度LAMP引物,但可以通过加热去除。所建立的基于LAMP的Las现场可视化检测方法的灵敏度比TaqManPCR高100倍,其可行性也通过实际样本的检测得到验证。综上,所建立的基于LAMP的Las现场可视化检测方法简单、快速、灵敏、可视化信号明显、无需复杂仪器设备,适用于Las的现场检测。(3)建立了基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)的Las现场快速可视化检测方法。设计了3组Las RPA引物并筛选出最优引物对,优化扩增温度为37℃。探究出NaOH核酸粗提法用于RPA检测Las的最佳处理时间为1 min。随后实验发现,SYBR GreenI可视化检测RPA扩增产物时,采用0.36μM引物的RPA体系扩增10min后加入1 pLSYBRGreenI并稀释2倍时,消除背景信号的效果最优。同时,引入一个一次性密闭卡盒,避免可视化检测时开盖操作引起气溶胶污染。所建立的基于RPA的Las现场快速可视化检测方法灵敏度和OI1/OI2cPCR方法相当,可行性也通过实际样本的检测得到验证。综上,所建立的基于RPA的Las现场快速可视化检测方法与之前报道的试纸条方法相比,更为简便、快速、经济,无需复杂昂贵仪器,检测过程只需15min,是资源匮乏地区和现场检测Las的较优方案。