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目的:检测人类椎间盘纤维环细胞在不同剂量IL-1β或(和)HMGB1干扰下PGE2、TNF-α、IL-6、IL-8和MMPs、TIMP-1 mRNA含量的变化;检测toll样受体-4、晚期糖基化终产物受体与IL-1β/HMGB1信号通路介导的椎间盘纤维环炎症损伤中的相关性;NF-κB信号通路与IL-1β/HMGB1信号通路介导的椎间盘纤维环炎症损伤中的相关性,为研究椎间盘退变的机制奠定基础,为防治纤维环细胞退变导致的椎间盘突出提供新的思路。方法:用0,0.5,1,2和5ng/ml IL-1β或(和)0,20,40和80ng/ml HMGB1干扰椎间盘纤维环细胞(购买于美国科学细胞研究室)及用2ng/ml IL-1β和(或)40ng/ml HMGB1干扰椎间盘纤维环细胞后0,6,12,24和48小时后,利用酶联免疫吸附法检测PGE2、TNF-α、IL-6、IL-8含量的变化,比较不同浓度及不同时限下其差别;再用2ng/ml IL-1β和(或)40ng/ml HMGB1干扰椎间盘纤维环细胞12小时后,利用RT-qPCR法和免疫印迹法检测MMP-1,-3,-9和金属基质蛋白组织抑制因子-1mRNA和蛋白的表达变化。分别用0,0.5,1,2和5ng/ml IL-1β干扰纤维环细胞12小时,利用RT-PCR方法检测TLR-2,-4,-6和RAGE的mRNA水平,后续再将实验分为四组,分别为空白对照组,40ng/mlHMGB1干扰组,2ng/ml IL-1β干扰组和40ng/mlHMGB1+2ng/ml IL-1β干扰组作用于椎间盘纤维环细胞,利用RT-PCR测量TLR-4和RAGE的mRNA水平,并比较四组间的差异;为了进一步研究TLR-4在IL-1β+HMGB1干扰椎间盘纤维环细胞炎症因子释放中的作用,利用慢病毒转染技术检测椎间盘纤维环细胞抑制TLR-4表达,将实验组SiRNA-TLR-4和对照组SiRNA-Control用转染浓度为30nM和60nM转染24小时后,比较实验组和对照组中TLR-4的mRNA和蛋白表达含量的变化,然后用IL-1β(5ng/ml)和HMGB1(80ng/ml)干扰转染浓度为60nM siRNA-TLR-4实验组及对照组椎间盘纤维环细胞,利用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中PGE2、TNF-a、IL-6及IL-8含量的变化。分别用2ng/ml IL-1β和40ng/ml HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞,利用免疫印迹法和RT-PCR法检测NF-κB、IκBα蛋白和mRNA的变化。全部实验均独立完成三次,结果采用均数±标准误表示,显著性水平设定为0.05。结果:1、2和5ng/ml IL-1β干扰椎间盘纤维环细胞后,PGE2和TNF-α含量显著性增高,1和2ng/ml IL-1β干扰椎间盘纤维环细胞后,IL-6和IL-8的含量显著性升高;40和80ng/ml HMGB1干扰椎间盘纤维环细胞24小时后,炎性细胞因子PGE2和TNF-α显著性上调,80ng/ml HMGB1干扰椎间盘纤维环细胞,IL-6和IL-8显著性上调。2、2ng/ml IL-1β和40ng/ml HMGB1分别干扰椎间盘纤维环细胞6,12,24和48小时后,2ng/ml IL-1β干扰12到48小时后和40ng/ml HMGB1干扰24到48小时后,PGE2显著性升高,当同时加有2ng/ml IL-1β和40ng/ml HMGB1后,PGE2升高的水平更为显著,差异具有统计学意义。同样,同时加有2ng/ml IL-1β和40ng/ml HMGB1后TNF-α,IL-6和IL-8显著性升高,其升高的水平显著高于单独应用IL-1β或HMGB1干扰。3、2ng/ml IL-1β干扰椎间盘纤维环细胞后,MMP-1和MMP-3mRNA的表达水平显著升高,40ng/ml HMGB1显著上调MMPs表达水平,2ng/ml IL-1β或者40ng/ml HMGB1单独作用于椎间盘纤维环细胞,对于TIMP-1mRNA的水平影响均不明显,而同时加有IL-1β和HMGB1对于椎间盘细胞金属基质蛋白则具有促进作用。4、2和5ng/ml IL-1β作用于椎间盘纤维环细胞后,TLR-2和TLR-4mRNA显著性上调,而TLR-6 mRNA的水平却未发生变化;40ng/ml HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞后TLR-2和TLR-4的表达水平显著升高,且40ng/ml HMGB1+2ng/ml IL-1β干扰组TLR4/RAGE mRNA水平升高的程度其他三组高,经RT-PCR检测TLR4/RAGE mRNA水平也同时升高。与对照组SiRNA-Control比较,siRNA-TLR-4抑制椎间盘纤维环细胞组其PGE2,TNF-α及IL-6含量显著下降,但IL-8的含量表达无变化。5、2ng/ml IL-1β和40ng/ml HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞后,NF-κB/p65 mRNA的水平显著升高,而40ng/ml HMGB1处理组,IκBαmRNA的水平显著下降,当用2ng/ml IL-1β联合40ng/ml HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞时,NF-κB/p65 mRNA的上调和IκBαmRNA的下降同时出现;免疫印迹技术检测NF-κB、IκBα蛋白的表达发现:2ng/ml IL-1β和40ng/ml HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞时,NF-κB/p65蛋白的表达显著上调,当用2ng/ml IL-1β联合40ng/ml HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞时,NF-κB/p65蛋白上调表达更为显著,与单纯2ng/ml IL-1β、单纯40ng/ml HMGB1组相比,差异具有统计学意义;2ng/ml IL-1β和40ng/ml HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞时,IκBα蛋白的表达显著下降,当用2ng/ml IL-1β联合40ng/ml HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞时,IκBα蛋白下降更为显著,与单纯2ng/ml IL-1β、单纯40ng/ml HMGB1组相比,差异具有统计学意义。结论:1、随着IL-1β和HMGB1浓度的升高,椎间盘纤维环细胞PGE2,TNF-α,IL-6和IL-8分泌逐渐升高,且两者共同作用时,其升高的更为显著。2、IL-1β和HMGB1可以促进椎间盘细胞金属基质蛋白MMP-1、MMP-3及MMP-9的分泌,但对于TIMP-1的影响不大。3、在椎间盘纤维环细胞中,除TLR-6外,随着IL-1β的升高,TLR-2、TLR-4、RAGE mRNA的表达显著上调。4、HMGB1和IL-1β联合干扰椎间盘纤维环细胞对TLR4/RAGE mRNA的上调作用具有叠加效应。5、IL-1β和HMGB1作用于椎间盘纤维环细胞后,NF-κB蛋白和mRNA表达显著上调,而IκBα蛋白和mRNA表达显著下降。6、HMGB1和IL-1β联合干扰椎间盘纤维环细胞对NF-κB、IκBα的上调和抑制作用具有叠加效应。本研究发现:在椎间盘纤维环细胞炎症损伤的诸多因素中,IL-1β和HMGB1协同叠加并呈剂量依赖性通过TLR4/RAGE信号通路引起的炎症损伤,是导致椎间盘纤维环细胞炎症损伤的原因之一。