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研究背景急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于冠状动脉闭塞、血流量急剧减少，导致相应心肌组织缺血缺氧，引起细胞能量代谢障碍和功能失调，救治不及时可能产生严重的心肌损伤甚至猝死。目前AMI治疗手段通常采取介入治疗或溶栓治疗尽快打开闭塞血管，恢复冠状动脉血流，挽救存活的心肌。然而，缺血/再灌注（ischemia reperfusion，I/R）和无复流（no-reflow，NR）造成的心肌损伤是缺血性心脏病治疗过程中的重要问题[1]。寻求一种积极有效地保护性治疗措施，抑制或减轻开通闭塞冠状动脉产生I/R和NR所致的心肌损伤，具有重要的临床意义。磁场的生物学效应愈来愈受到人们的重视，研究发现磁场通过不同的机制可使分子细胞、组织器官甚至整个机体发生形态和功能的改变[2]。研究显示：磁场具有抗炎、抗氧化、抗血栓、促进一氧化氮（NO）生成等生理效应，并能抑制主动脉内粥样斑块的形成，还可促进缺血心肌组织的血管修复与新生[3-5]，并能有效抑制I/R导致的大鼠心肌损伤，进而改善心脏功能[6-8]。然而，关于磁场对I/R引起的心肌细胞损伤保护机制机理尚不清楚。因此，我们对磁场、NO、氧化应激与心肌缺血的关系进行梳理，本实验旨在观察低频脉冲磁场（LF-PMFs）对缺氧/复氧（H/R）条件下SD乳鼠心肌细胞的影响，研究一氧化氮/过氧亚硝基阴离子（NO/ONOO-）及通路在磁场对H/R条件下心肌细胞损伤中的地位与作用，并进一步探讨磁场的保护机制。研究目的1.观察不同参数LF-PMFs对H/R条件下乳鼠心肌细胞增殖与凋亡的影响，筛选出最佳磁场。2.观测LF-PMFs对H/R的心肌细胞NO/ONOO-及其通路的影响，研究探讨磁场作用的保护机制与NO/ONOO-之间的关系。实验方法采用酶消化法分离SD乳鼠心肌细胞，差速贴壁法提纯心肌细胞，运用形态学和免疫组化染色法（cTnI）鉴定心肌细胞，MTT比色法测绘心肌细胞生长曲线；建立SD乳鼠心肌细胞的H/R模型，缺氧与复氧的时间分别为3h；选取磁场参数：磁场为矩形波，频率为15Hz、20Hz，磁场强度为1.5mT、3.0mT、4.5mT、6.0mT；作用时间分别为1h、3h、5h。将SD乳鼠心肌细胞随机分为3组：（1）对照组（Control）：常规培养心肌细胞，不做任何干预；（2）H/R组：心肌细胞进行缺氧和复氧处理；（3）磁场组：在心肌细胞缺氧前用LF-PMFs干预，观察磁场对心肌细胞损伤的预防作用，复氧后用LF-PMFs干预以观察磁场对损伤心肌细胞的治疗效果。心肌细胞进行H/R和LF-PMFs干预后，用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡程度，MTT比色法检测细胞的增殖活性，观察比较不同LF-PMFs对H/R条件下心肌细胞的影响，筛选出最佳磁场参数；然后用最佳磁场和H/R作用心肌细胞后，WST-1法和免疫组化染色法（Dihydroethidium，DHE）检测O2-，Griess法测定NO和ONOO-，化学发光法检测NADPH氧化酶活性；免疫印迹法（Western Blot）检测eNOS磷酸化水平。实验结果1．在H/R条件下，LF-PMFs可促进乳鼠心肌细胞增殖，抑制其凋亡；4.5mT、15Hz作用时间3h的磁场保护效果显著。2.LF-PMFs可减少H/R损伤的心肌细胞O2-含量：对照组（0.2670.049μmol/L）、LF-PMFs+H/R组（0.3260.055μmol/L）和H/R+LF-PMFs（0.3240.056μmol/L）组O2-生成较H/R组（0.4010.116μmol/L）明显减少（P<0.05），提示LF-PMFs能抑制H/R乳鼠心肌细胞O2-的生成。3．LF-PMFs对H/R损伤的乳鼠心肌细胞NO及ONOO-生成的影响：H/R组（3.151.06μmol/L）较对照组（5.742.26μmol/L）和磁场组（4.521.95μmol/L、4.581.60μmol/L）NO生成明显减少（P<0.05），而H/R组（27.425.74μmol/L）较对照组（18.124.08μmol/L）和磁场组（21.675.45μmol/L、20.855.77μmol/L）ONOO-生成明显增加（P<0.05），磁场组间无明显差别（P>0.05）；H/R组NO/ONOO-比值较磁场组明显降低（P<0.05），磁场组间无显著差异（P>0.05）。4．化学发光法检测NADPH氧化酶活性：与H/R组比较，磁场组能显著降低H/R损伤的乳鼠心肌细胞NADPH氧化酶活性（P<0.05）。5．Western Blot检测心肌细胞eNOS磷酸化水平：磁场可增加心肌细胞eNOS磷酸化表达，对H/R损伤的乳鼠心肌细胞具有保护作用（P<0.05）；磁场组间无显著差别（P>0.05）。结论1．H/R损伤的SD乳鼠心肌细胞经过15Hz4.5mT的矩形波LF-PMFs干预3h，显著促进心肌细胞增殖活性并抑制其凋亡程度。2．磁场对H/R损伤的心肌细胞保护作用可能是通过调节NO/ONOO-平衡来实现的，其具体机制为：增强心肌细胞eNOS磷酸化表达，增加NO产量；同时又抑制NADPH氧化酶的活性，减少心肌细胞O2-生成量，进而降低ONOO-含量，调节NO/ONOO-平衡。