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研究背景辛伐他汀(Simvastatin,SVA)及羟基胆固醇(Hydroxycholesterol,OHC)都是小分子物质,已获得市场准入。辛伐他汀是降低胆固醇的药物,而羟基胆固醇是经胆固醇代谢途径的中间产物之一,是含氧的胆固醇衍生物。辛伐他汀已被认为具有成骨诱导性,但存在剂量依赖性、物种个体差异、用药途径差异、衰减、抑制干细胞增殖等问题,同时也降低了有利于成骨活性的羟基胆固醇水平,因此不完全有利于成骨[1-6]。羟基胆固醇是成骨诱导因子,其中20(S)羟基胆固醇促进成骨作用尤为显著,同时可刺激内源性细胞诱导因子BMP-2的分泌[7,81。辛伐他汀对干细胞后期增殖有抑制作用,可通过促进成骨分化来增强成骨效能,羟固醇可促进干细胞的早期增殖,同时促进成骨分化。辛伐他汀和20(S)羟基胆固醇对成骨效能都存在显著影响,其作用机理存在相似及互补性,并且可能激活与成骨密切相关的ERK/MAPKs细胞信号通路[5-7,9,10]。由此推测,辛伐他汀中添加20(S)羟基胆固醇可能通过中和辛伐他汀对干细胞增殖的抑制作用或存在成骨相关信号通路的协同调控机制,从而进一步增强骨原细胞增殖活性及成骨分化,促进骨再生和骨愈合。研究目的探讨SVA与20(S)OHC联合应用对体外骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、凋亡和成骨分化的影响;探讨SVA与20(S)OHC复合Bio-Oss骨粉修复兔颅骨缺损的成骨效应及特征;研究SVA与20(S)OHC对BMSCs细胞活性和成骨分化的调控机制。研究方法1.SVA与20(S)OHC联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响:大鼠BMSCs分别在四组含不同浓度SVA诱导液中培养,7天采用MTT法、PCR方法检测成骨相关基因ALP、OCN、BMP的mRNA水平;以20(S)OHC与SVA各自最合适浓度设置四个实验组,在培养的第3、7天通过MTT和膜联蛋白V凋亡检测评估各组对BMSCs的细胞增殖和细胞凋亡的影响,以及在细胞培养的第3、7、14天进行茜素红染色及PCR方法检测成骨相关基因ALP、OCN、BMP 的 mRNA 水平。2.SVA与20(S)OHC复合Bio-Oss骨粉修复兔颅骨缺损的动物实验:选取新西兰健康雄性白兔14只,约6月龄,体重2.5-3kg,按实验方案设置四个实验组;于术后4、6周处死各组动物,取出兔颅骨标本进行大体形态学和影像学研究新骨形成的特征;对4周标本进行脱钙切片,采用HE染色、免疫组化染色(BMP-2)和马松染色检测缺损修复情况。3.SVA与20(S)OHC对BMSCs成骨效能的调控机制研究:采用Western blot方法检测Ras-MAPK信号通路相关蛋白的表达水平;各组细胞培养液中加入或不加入U0126抑制剂,并以等量的DMSO作为实验对照组,共设置8个实验组,3天、7天后终止培养。检测评估各组对BMSCs的细胞增殖和细胞凋亡的影响,及检测成骨相关基因ALP、OCN、BMP-2及BMP-9的mRNA水平。研究结果1.SVA存在剂量依赖性,高浓度的SVA(0.25和1.0 μM)可增强成骨相关基因的表达但衰减细胞的活性。添加5μM 20(S)OHC后,可以中和SVA对BMSCs的抑制作用。2.组织学检查证实联合应用SVA和20(S)OHC可协同促进兔颅骨缺损模型骨再生。3.同时添加SVA和20(S)OHC可显著增强BMSCs的ALP活性、钙沉积、成骨相关基因(ALP、OCN和BMP-2)表达,成骨效应可被抑制剂U0126抑制减弱,表明Raf/MEK/ERK信号通路发挥重要作用。研究结论SVA/20(S)OHC联合应用激活Raf/MEK/ERK信号通路,促进内源性骨诱导因子BMP-2的增加,同时协同增强干细胞增殖和成骨分化。SVA/20(S)OHC配方可作为骨诱导药物促进骨愈合,具有骨再生的临床应用前景。